基于D152樹脂吸附蛋白質結合SERS測定魚肉中的鳥嘌呤含量

黃棟瑋，谷貴章，胡科娜，高興杰，張進杰,*，楊文鴿，徐大倫

（1.寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315000；2.湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州 313000）

嘌呤是所有人體細胞和多數食物中存在的天然物質，在食品中廣泛存在[1]。當嘌呤攝入過多超出人體代謝能力后，嘌呤在體內代謝的最終產物是尿酸，而尿酸在體內沉積會導致高尿血癥甚至痛風[2-3]。隨著經濟水平的提高以及人們飲食習慣的改變，痛風和高尿血癥患者逐年增多[4]。截止2019年，我國痛風患者超8 000萬，高尿血癥患者超1.7億，已經使痛風成為我國第二大代謝疾病[5]。水產類食品是高嘌呤風險類食品，有研究表明，水產食品的攝入與痛風存在一定聯系[6]。不同種類的水產食品嘌呤含量差異顯著，且加工方法和貯存條件的不同對水產食品中游離嘌呤種類和含量也有影響，但相關水產食品中的嘌呤含量的實時監測方法尚不完全。大多數貝類、魚類中鳥嘌呤和腺嘌呤的含量超過總嘌呤的60%，鳥嘌呤含量能一定程度上反映水產食品中總嘌呤的含量[7]。因此本實驗對魚肉中的鳥嘌呤含量快速檢測方法進行研究，以期為水產品膳食提供指導，最終為降低痛風患病率提供科學借鑒。

表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）是由于分子振動而產生的散射光譜，可提供有關分子結構特征的信息[8-10]。通過納米結構金屬材料的應用，拉曼強度可以提高到108～1012倍，從而放大拉曼散射信號[11-12]。由于其超高的靈敏度，獨特的光譜指紋圖譜，低成本，簡單的樣品制備，快速和無損的分析功能[13-14]，該技術已發展成為一種強大的靈敏分析工具，可用于生物傳感、化學和生化分析、微生物和環境監測[15]，根據分析物的SERS光譜產生定性和定量信息[16]。

嘌呤近年來的檢測也逐漸成為熱點，史瀟楠[17]使用密度泛函理論計算腺嘌呤的SERS，并與已有的拉曼光譜、表面增強超拉曼光譜進行比較，結果顯示，腺嘌呤的SERS理論計算結果和樣品檢測結果相符；楊倩倩[18]利用Ag/Si-NPA作為SERS活性基底，分別對鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶進行檢測，3 種堿基的特征拉曼光譜均不同，其中胞嘧啶檢出限可達10-9moL/L。蔡路昀[4]和Choi[19]等分別描述了國內外嘌呤檢測中樣品的前處理及液相色譜法、離子色譜法等方法的研究進展和嘌呤與人體的健康關聯，但是目前嘌呤檢測的問題主要為各嘌呤之間的pKa（酸度系數）值相近，很難達到完全分離。林洪等[20]總結了一系列嘌呤的檢測方法，但是沒有形成統一的標準。拉曼檢測快速且靈敏度高，但是存在樣品本身純度不高而使干擾度較大，就會影響目標物的檢測[21]。例如，孟娟[22]建立了一種液液微萃取的方法對尿液中的可卡因快速分離和純化的前處理，因為尿液中的毒品含量很少，而尿素、蛋白質和氨基酸會影響檢測，純化后結合SERS技術對可卡因有很好的檢測結果，整個純化及檢測只需要3.5 min，適用于現場的毒品檢測。

大孔吸附樹脂是20世紀60年代出現的一類新型非離子型高分子吸附劑，是由苯乙烯、二乙烯苯或甲基丙烯酸酯等聚合成的高分子孔狀結構[23]。其理化性質穩定，主要通過分子間作用力進行吸附，同時，本身的多孔性結構使它具有一定的分子篩作用。利用不同極性、不同孔徑樹脂的吸附特性和分子篩作用可以分離純化不同化合物[24]。劉劍虹等[25]利用大孔強堿性陰離子交換樹脂對酪蛋白磷酸肽進行提純，結果表明，在最佳條件下，回收率達到77.7%～80%；郭慧靜等[26]利用4 種不同類型的樹脂對蒲公英多糖脫色效果研究，結果顯示，S-8樹脂脫色率達86.45%，多糖損失率只有18.9%；吳皓等[27]的研究表示732型陽離子樹脂可以去除珠蚌中的蛋白質，且方法溫和，活性成分損失少。由于樹脂與物質之間的吸附為物理吸附，使物質易洗脫，并且成本低、效率高、穩定性好和容易再生，大孔吸附樹脂分離技術現已在化工、醫藥和食品行業廣泛運用。

本實驗以魚肉中的鳥嘌呤作為檢測目標物，基于大孔樹脂的除雜能力去除魚肉樣品中蛋白質等為主的干擾物，再以SERS作為檢測手段，以銀包金納米顆粒（silver-coated gold nanoparticles，Au@Ag NPs）為基底，檢測魚肉樣品鳥嘌呤的含量，以期為魚肉嘌呤風險檢測提供一種有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮帶魚2020年3月10日購自浙江省寧波市路林市場。

鳥嘌呤（≥99%）、氯金酸（HAuCl4，98%）、L-抗壞血酸（C6H8O6，99%）、4-巰基苯甲酸（99%）、硝酸銀（AgNO3，99.95%）、檸檬酸鈉（C6H5Na3O7，98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白、D152大孔弱酸型陽離子交換樹脂 北京索萊寶生物科技有限公司；D3520非極性大孔樹脂 天津鴻博美化工科技有限公司；D101大孔吸附樹脂 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

XploRA ONE高靈敏度拉曼光譜儀 上海HORIBA Scientific公司；D-7PC紫外-可見分光光度計 南京菲勒儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

樹脂預處理：先用水將樹脂充分膨脹24 h，然后用3.6%的稀鹽酸浸泡4～6 h去除其中的無機雜質，逐漸稀釋洗凈再用3.6%氫氧化鈉溶液浸泡4～6 h，洗至中性。采用濕法裝柱，將活化后的樹脂裝入1 cm×20 cm層析柱中進行實驗。

魚肉預處理：新鮮帶魚去頭去尾去骨洗凈瀝干水分，取魚肉于絞肉機內攪碎，攪碎的魚肉于冰箱-20 ℃保存備用。

1.3.2 鳥嘌呤標準溶液的制備

稱取0.01 g鳥嘌呤，加入6 mL氫氧化鈉（0.01 mol/L）溶解后，再用蒸餾水定容至100 mL，4 ℃避光保存。吸取儲備液（50 mg/L），用超純水分別稀釋成10、5、1、0.1、0.01、0.001 mg/L的標準溶液。

1.3.3 蛋白標準儲備液的制備

稱取30 mg牛血清蛋白，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，得到質量濃度為3 mg/mL的蛋白質標準溶液，不同質量濃度需要時進行相應稀釋即可。

1.3.4 磷酸鹽洗脫液的制備

稱取2.712 8 g KH2PO4，加入800 mL超純水溶解，然后用磷酸溶液調節pH值，再用超純水定容至1 000 mL，置于4 ℃保存。

1.3.5 正交試驗設計

對不同上樣流速、洗脫液pH值以及洗脫流速進行正交試驗優化，以0.1 mg/mL鳥嘌呤標準溶液經過樹脂過濾后含量作為評定結果，因素及水平見表1。

表1 正交試驗水平及因素Table 1 Independent variables and their levels used in orthogonal array design

1.3.6 Au@Ag NPs的制備

參照文獻[28]。主要分為兩步，第1步合成納米金（Au NPs）∶515 μL的HAuCl4（2%）加到100 mL去離子水中搖勻，磁力攪拌加熱到溶液沸騰后加入1 mL檸檬酸鈉（1%），持續加熱30 min，冷卻后得到紫紅色的金納米顆粒。第2步即向10 mL金納米溶液中加入1.5 mL抗壞血酸（0.1 mol/L）溶液，再以1 滴/min速率加入3.5 mL AgNO3（1 mmol/L）溶液，此過程需要一直磁力攪拌，AgNO3加完后溶液由紫紅色變為橘黃色，得到Au@Ag NPs。

1.3.7 實際樣品的溶液制備

參考任麗琨[29]的方法修改，稱取200.0 mg魚肉樣品于10 mL離心管中，加入1.238 mol/L的高氯酸溶液3 mL，置于沸水浴中水解60 min，冷卻，用1 mol/L KOH溶液調節pH值至中性，定容至10 mL，以3 000 r/min離心30 min，用濾紙濾去大部分沉淀物，取濾液2.0 mL，用1 mol/L H3PO4溶液調節pH值至4，定容至5.0 mL，用0.45 μm針頭過濾器過濾，4 ℃保存備用。

1.3.8 蛋白含量檢測

參照魏思敏等[30]的方法將蛋白質標準溶液進行紫外表征。取1 mL蛋白質標準溶液放入石英比色皿中，采用紫外分光光度計在波長254 nm處對蛋白質標準溶液的吸光度進行讀取。

1.3.9 SERS樣品的制備

取3 μL Au@Ag NPs基底與鳥嘌呤溶液的混合液于石英載玻片上，利用LabSpec 6.0軟件，在樣品干燥前進行數據采集。SERS光譜采集的激光波長為785 nm，激光強度100%，10×目鏡，采集時間4 s，累計次數5 次，光譜范圍200～2 000 cm-1。樣品檢測過程中參數設置不變，每個樣品檢測重復3 次，保證數據的準確性。

1.3.10 回收率實驗

根據標準品加標量，稱取已知鳥嘌呤濃度的樣品分別加入3 個水平的鳥嘌呤混合標準液（300、600、900 mg/kg），根據已確定的SERS檢測條件檢測3 次，計算鳥嘌呤平均回收率。

1.4 數據處理

使用Origin 9.0軟件對光譜數據圖進行繪制；采用Excel軟件對平均值、標準差等數值進行計算；利用SPSS Statistics 21.0軟件對原始數據進行顯著性差異分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 樹脂的選擇

在魚肉提取液中，由于魚肉組成的特殊性，存在蛋白質、其他嘌呤嘧啶以及殘存的重金屬離子等干擾雜質，其中蛋白質占主要影響，因此需要將魚肉樣品進一步純化。對于具有基本特征的嘌呤堿基，可以使用離子交換柱分離其離子形式。根據相關研究結果[31-33]，以牛血清標準蛋白作為參考，選擇對蛋白質具有吸附作用的樹脂對嘌呤的洗脫作用進行研究。具體樹脂信息如表2所示，結果顯示D152樹脂在3 種樹脂中有最高的蛋白吸附率。

表2 不同樹脂對蛋白的吸附Table 2 Adsorption capacity of different resins for proteins

離子交換樹脂中含有一種或幾種化學活性基團，屬于交換官能團，在水溶液中能解離出一些陽離子（如H+或Na+）或陰離子（如OH-或Cl-），同時吸附溶液中原來存有的其他陽離子或陰離子[34]。堿基和核苷在酸性水溶液中能發生電離而以陽離子形式存在，嘌呤屬于弱堿，酸型陽離子交換固定相可以增強其保留，從而實現多種物質的分離。

鳥嘌呤的pKa為9.92。任麗琨[29]研究結果發現，用磷酸鹽作為流動洗脫液可以有效提高檢測的準確性，且磷酸鹽的pH值直接影響緩沖鹽的離子強度，適宜的pH值可以保證其生物活性。所以將磷酸鹽用于樹脂內嘌呤的洗脫，使離子形式的鳥嘌呤形成分子，以便使嘌呤的回收率提高。

洗脫液pH值對鳥嘌呤分離具有顯著影響。利用鳥嘌呤堿基標準溶液，研究在不同pH值（3.7、4.0、4.2、4.5、4.8）洗脫液下相同濃度（0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液）洗脫液分離和峰形的影響。

經預實驗，選擇鳥嘌呤質量濃度為0.1 mg/mL作為洗脫液pH值優化實驗的進樣濃度。如表3所示，鳥嘌呤在不同樹脂以及不同洗脫液的pH值下，吸附率存在顯著差異（P＜0.05）。D101和D3520樹脂分別在洗脫液pH值為4.0和4.2時得到最低的吸附率，吸附率分別為3.29%和3.23%，而D152樹脂在洗脫液pH值為4.0時有最低的吸附率2.09%。綜上所述，選擇D152樹脂作為填充料，上樣質量濃度為0.1 mg/mL且洗脫液pH值為4.0時，鳥嘌呤有最低吸附率2.09%，其濾除率大于95.62%。

表3 樹脂在不同pH值洗脫腋下對鳥嘌呤的吸附Table 3 Adsorption of guanine onto macroporous resins at different eluent pH levels

另外，用不同樹脂對牛血清蛋白（3 mg/mL）的吸附研究實驗，增加實驗結果的可靠性，實驗結果見表4。不同樹脂對蛋白的吸附差別顯著，所選的3 種樹脂對蛋白的吸附率為D152＞D101＞D3520，其中D152在洗脫pH值為4.0時最高吸附率達到91.18%，D3520樹脂的吸附率最低為67.90%（pH 4.8）。D152樹脂對蛋白的吸附率為83.11%～91.18%，原因是D152有更大的比表面積和孔徑，更利于蛋白分子的進入，有研究表明比表面積和孔徑是反映吸附能力的決定性因素。

表4 樹脂在不同pH值洗脫液下對蛋白的吸附Table 4 Adsorption capacity of macroporous resins for proteins at different eluent pH levels

綜上，結合樹脂對鳥嘌呤的吸附作用，選用D152樹脂作為下一步實驗研究的樹脂。

2.2 正交試驗優化

如表5所示，不同條件實驗對鳥嘌呤的影響因素為上樣流速＞洗脫流速＞洗脫液pH值。上樣流速越快，堿基與樹脂接觸時間越短，吸附率會相對低，同樣對于蛋白樣品，流速越慢，蛋白越能夠被樹脂吸附，達到更高的吸附率；洗脫流速越慢，樹脂上所吸附的物質越能被洗脫干凈。因此對堿基溶液的正交試驗結果進行驗證，驗證實驗綜合最優的實驗條件：上樣流速為3 mL/min，洗脫液pH值為4.0以及洗脫流速為0.5 mL/min。

表5 正交試驗設計及結果Table 5 Orthogonal array design with experimental results

2.3 SERS檢測

2.3.1 標準品的SERS檢測

如圖1所示，主要拉曼光譜峰均出現在300～2 000 cm-1位移范圍內。鳥嘌呤具有其獨特的SERS指紋圖譜。鳥嘌呤在不同質量濃度下都具有相似的峰形，隨著質量濃度的升高，可以看出雖然鳥嘌呤的大部分特征峰在光譜中都有所體現并且增強，但增強程度不同。即隨著質量濃度的變化伴隨著一些振動峰的消失和新振動峰的出現。

將配制好的鳥嘌呤標準溶液（50 mg/L）分別稀釋至0.001、0.01、0.1、1、5、10 mg/L，然后在基底中分別添加等量不同質量濃度的鳥嘌呤溶液，混合均勻后，取3 μL溶液于石英載玻片上，進行光譜采集。激發光源波長785 nm，功率38 mW，采集時間3 s，累積次數5 次。

從圖1可以看出，以Au@Ag NPs為基底對鳥嘌呤進行檢測具有很好的信噪比和光譜分離性，且光譜特征峰與相關文獻報道吻合[35]。隨著質量濃度的降低，大致的峰形沒有改變，當鳥嘌呤溶液質量濃度低至0.1 mg/L時也可以看見鳥嘌呤環呼吸振動的特征峰，顯示出Au@Ag NPs活性基底具有極高的檢測靈敏度。由鳥嘌呤的檢測結果可知，SERS可提供極高的靈敏度，為分子低濃度的檢測提供了可能。鳥嘌呤標準曲線在質量濃度0.001～100 mg/L的范圍內顯示良好的線性關系，相關系數R2為0.969 9。

圖1 不同質量濃度鳥嘌呤的SERS光譜Fig.1 SERS spectra of different concentrations of guanine

2.3.2 蛋白質標準品以及與鳥嘌呤混合溶液的SERS檢測

以Au@Ag NPs為SERS活性基底，用與鳥嘌呤檢測的同樣方法對標準牛血清蛋白質溶液進行檢測，結果如圖2所示。蛋白質過柱前的拉曼指紋圖譜可以清晰地展現出各基團對應的峰值，而過柱后蛋白質幾乎被樹脂吸附，即流出液中蛋白質含量很少，在對應溶液檢測出的SERS結果中，相應的特征峰值也變弱且部分特征峰也隨之消失。

圖2 蛋白溶液過柱前后的SERS檢測對比Fig.2 Comparison of SERS signal intensity before and after passing the protein solution through the column

在上述蛋白質標準溶液和鳥嘌呤標準溶液的SERS檢測中，結果清晰表現出蛋白質和鳥嘌呤各自的特殊指紋圖譜。因此，在以上實驗基礎上，將2 種標準溶液進行混合，分別對過柱前的混合溶液與過柱后的混合溶液進行對比。如圖3所示，過柱前的混合溶液中，鳥嘌呤的特征峰表現得不明顯，是因為存在蛋白質等物質對鳥嘌呤的干擾，相比之下過柱后混合溶液中的鳥嘌呤的SERS檢測中，鳥嘌呤的拉曼特殊指紋表現得相對明顯，與標準鳥嘌呤溶液的SERS檢測結果相差無幾。因此結合上述實驗結果表明D152樹脂對蛋白質有很好的吸附作用且對鳥嘌呤的吸附性較小。

圖3 蛋白質與鳥嘌呤混合溶液過柱前后的SERS檢測對比Fig.3 Comparison of SERS signal intensity before and after passing the mixed solution of protein and guanine through the column

2.3.3 鳥嘌呤與其他堿基混合的SERS檢測

基于嘌呤對人體存在危害對于魚肉成分組成的復雜性，對含量較多的鳥嘌呤進行檢測，但是帶魚魚肉中還存在其他嘌呤堿，需要把其他堿基對鳥嘌呤SERS的檢測影響進行分析。由于帶魚中除了鳥嘌呤，腺嘌呤含量最高，因此，根據帶魚組分中鳥嘌呤和腺嘌呤的比例，在不同質量濃度的鳥嘌呤溶液（50、10、5、1、0.5、0.1 mg/L）中適量添加同質量濃度的腺嘌呤溶液（0.5 mg/L），對此進行SERS檢測，結果見圖4。適量腺嘌呤溶液的加入對鳥嘌呤溶液的SERS檢測存在較小影響，對比圖1檢測結果，鳥嘌呤的拉曼指紋圖譜并未因腺嘌呤溶液的加入而發生很大變動，所以可以推斷，其他含量更少的堿基對本研究的影響更小，不會影響實驗結果。

圖4 鳥嘌呤與腺嘌呤混合溶液SERS檢測Fig.4 SERS detection of mixed solutions of 0.5 mg/L adenine and guanine at different concentrations

2.3.4 樣品溶液的SERS檢測

將正交試驗結果略做調整，具體如下：上樣流速為1 mL/min，洗脫劑pH值為4，洗脫流速為0.5 mL/min。因為上樣流速越慢，蛋白質吸附到樹脂上的量越多，考慮到實驗周期，也不適宜選擇過慢的上樣速度；洗脫流速0.5 mL/min時可以盡可能的洗脫掉吸附到樹脂上的堿基，提高堿基通過率。事實上，柱內樹脂體積越大，吸附效果越好，但根據本實驗中的上樣量，設置柱內樹脂填裝內徑及柱高為1 cm×20 cm即可。樣品溶液過柱時，可在不同時間收集流出液得到不同的堿基樣品，收集液于4 ℃保存。

將通過樹脂吸附的魚肉提取液樣品溶液進行SERS檢測；同時采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對魚肉中鳥嘌呤含量進行檢測，結合HPLC的檢測結果對比[36]，結果見表6、圖5。過柱前的SERS指紋圖譜主要體現為蛋白的特征峰，過柱后的濾液檢測出鳥嘌呤的特征峰更顯著。因為混合溶液中蛋白質分子較大，更容易被聚焦檢測到，而提取液經樹脂吸附后將蛋白幾乎吸附在樹脂上，降低了對目標物質鳥嘌呤檢測的干擾。對比HPLC方法，SERS可以檢測到更低濃度的鳥嘌呤，且靈敏度更高，檢測結果更穩定。根據鳥嘌呤不同質量濃度以及對應的拉曼強度值，計算得到標準曲線為y=120.08x+391.46，R2=0.969 9，對質量濃度為50 mg/mL的鳥嘌呤標準溶液進行多次重復性實驗，得到鳥嘌呤的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.4%，表示銀包金顆粒與堿基可以很好地耦合，得到理想的拉曼指紋圖譜比較穩定。

表6 不同檢測方法檢測鳥嘌呤對比結果Table 6 Comparison of HPLC and SERS for guanine determination

圖5 魚肉提取液過柱前后的SERS圖Fig.5 SERS spectra of fish flesh extract before and after passing it through the column

2.3.5 回收率實驗結果

選擇已知鳥嘌呤含量的樣品，加入3 個質量濃度水平的鳥嘌呤混合標準溶液，在上述SERS條件下進行檢測回收，結果如表7所示，其回收率均大于98.78%，平均回收率達101.26%，表明該方法能夠對鳥嘌呤溶液較好地定量檢測。

表7 鳥嘌呤回收率實驗結果（n=3）Table 7 Recovery of guanine spiked in known sample (n = 3)

3 討 論

離子交換樹脂是通過分子間的作用力進行吸附，同時基于分子篩的作用利用不同極性及孔徑的樹脂分離純化不同物質。離子交換的機理是基于特定化合物以離子形式存在的能力，當化合物變成不再保留在樹脂上的中性分子時，也可以通過改變洗脫液的pH值洗脫。在整個離子交換過程中，pH值影響目標分離物的電離度[37]。物質的pKa是確定環境pH值的重要因素。對于?OH，非離子和離子形式之間的平衡如式（1）所示：

解離常數Ka由式（2）、（3）定義：

化合物的組成隨pH值的變化而變化，取決于離子或非離子形式的pH值可以是水溶液中存在的主要成分。當一種形式代表化合物約占99%時，它被認為是化合物的主要成分。

基于大孔樹脂的分離純化，許英一等[32]對6 種大孔樹脂對苜蓿葉蛋白肽的吸附效果進行研究，結果顯示DA201-C型樹脂在上樣流速為0.5 mL/min，上樣質量濃度為10 mg/mL，75%乙醇溶液為洗脫劑，洗脫流速為0.5 mL/min等條件時，苜蓿葉蛋白肽含量提高了46.95%，糖和鹽以及其他雜質含量分別降低了81.88%和70.97%。段生洲等[31]也選用6 種大孔吸附樹脂對白鰱魚糜漂洗水中的蛋白進行吸附，結果表明6 種樹脂吸附能力為HP-20＞XAD-16＞D101＞X-5＞AB-8＞D3520，HP-20樹脂對漂洗水蛋白的吸附率最高可達94.79%。楊萬根等[38]選用9 種不同樹脂對蛋清蛋白水解液進行脫鹽處理，其中DA201-C樹脂的吸附率為80.85%。根據以上研究結果顯示，大孔樹脂對蛋白吸附有作用，因此本研究采用D152大孔樹脂對魚肉組織液中嘌呤進行分離，即選用樹脂對魚肉提取液中的蛋白質進行吸附，提取魚肉中的游離嘌呤，再結合SERS技術對嘌呤含量進行檢測。

對于嘌呤的檢測，已有HPLC、液相色譜-質譜和毛線管電泳等方法，每種方法都有各自的優點和局限性。HPLC分析時間較長[39]，液相色譜-質譜不能保證嘌呤的分離[40]，毛線管電泳注入體積小、光路短、影響檢測靈敏度[41]。例如呂兵兵等[36]利用反相高效液相色譜對帶魚魚糜中游離嘌呤和總嘌呤含量的檢測，前處理及檢測過程時間較長。但相比這幾種方法，SERS利用金屬納米粒子的表面等離子體特性增強拉曼散射信號的表面敏感現象，SERS技術操作更簡便，靈敏性更高，檢測耗時較短。同時，SERS檢測過程中也存在非目標成分的干擾，因此需要將目標檢測物純化分離，目前常用的去除干擾的方法有液液萃取和大孔樹脂吸附過濾。

水產品在運輸以及貯藏過程中品質劣化較快，因此需要一種簡便且快速的檢測方法監測水產品質量安全。本研究開發一種將目標檢測物分離純化的方法，即利用D152大孔樹脂將魚肉提取液進行純化，將蛋白和糖類等雜質吸附，再將濾液與SERS活性基底結合檢測嘌呤的方法。結果顯示，該方法可以檢測單個嘌呤的含量，且檢出限低于已開發的HPLC檢測方法。

4 結 論

利用大孔樹脂作為蛋白和堿基分離的介質，將蛋白質吸附到樹脂上，從而分離目標物質鳥嘌呤，再結合SERS技術檢測鳥嘌呤。該方法可以降低蛋白質對鳥嘌呤檢測的干擾，且可以檢測到的鳥嘌呤拉曼指紋圖譜效果較好。結果表明樹脂對鳥嘌呤吸附實驗最優條件為上樣流速3 mL/min，洗脫液pH 4，洗脫流速0.5 mL/min；鳥嘌呤標準品在SERS檢測中最低質量濃度為0.1 mg/L。根據鳥嘌呤標準溶液進行SERS檢測的數據制作的標準曲線，相關系數R2為0.996 9，且鳥嘌呤SERS檢測時精密度實驗較好，RSD為1.4%。因此，本實驗利用樹脂純化蛋白結合SERS技術，可以很好檢測嘌呤堿，為日后食品中相關堿基檢測提供一定理論依據。