一種快速檢測(cè)Hg2＋的比率熒光傳感器構(gòu)建

賈寶珠，戚凱欣，樊怡飛，蔡美玲，廖彩霞，羅雙子，古宗婷，蔡常宇，韋曉群，徐振林，羅 林,*

（1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

隨經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，重金屬離子在各領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但與此同時(shí)也帶來(lái)了環(huán)境污染與食品安全問(wèn)題。我國(guó)是農(nóng)業(yè)出口大國(guó)，而農(nóng)產(chǎn)品中重金屬污染成為我國(guó)食品貿(mào)易亟待解決的巨大障礙[1]。其中汞離子（Hg2+）是常見(jiàn)的劇毒重金屬離子之一，其可通過(guò)水、空氣和土壤等方式進(jìn)行遷移，并以食物鏈的形式進(jìn)入人體，在肝臟、腎臟、腦部等器官富集，從而危害人體的生命健康[2]。1956年日本因工業(yè)廢水的排放造成食品、水源污染的“水俁病”[3]。因此，從貿(mào)易利益和國(guó)民食品安全的角度出發(fā)，世界各國(guó)對(duì)食品中Hg2+殘留的監(jiān)測(cè)日益嚴(yán)格，這也要求Hg2+的檢測(cè)技術(shù)不斷進(jìn)步。

傳統(tǒng)檢測(cè)重金屬離子主要基于儀器分析法，如原子吸收光譜法[4-8]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[9-11]。儀器法準(zhǔn)確度高、精密度好、檢出限低，但是操作繁瑣、設(shè)備成本高、較難用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。隨著納米科技近些年的快速發(fā)展，利用納米材料構(gòu)建檢測(cè)重金屬離子的傳感器已成為研究熱點(diǎn)之一，其中熒光傳感器由于靈敏度高、操作簡(jiǎn)便更備受關(guān)注。然而，現(xiàn)今檢測(cè)Hg2+的熒光傳感器大多為“turn-off”模式（熒光猝滅型）[12-13]和“turn-on”模式（熒光猝滅型）[14-16]。此類(lèi)以單一熒光強(qiáng)度為檢測(cè)信號(hào)的熒光傳感器，易受探針濃度、pH值等外界環(huán)境因素的干擾，導(dǎo)致其精確度相對(duì)較弱。而通過(guò)測(cè)定在同一激發(fā)波長(zhǎng)下兩個(gè)發(fā)射強(qiáng)度比值變化的比率熒光傳感器，由于兩個(gè)發(fā)射峰強(qiáng)度受到的外界干擾一樣，兩者的比值一定程度上抵消了外界干擾因素，具有自帶內(nèi)標(biāo)效應(yīng)，因此該類(lèi)傳感器具有更高精密度、信噪比及靈敏度，已成為當(dāng)前熱門(mén)研究方向。Zhang Zhenzhen等[17]構(gòu)建了基于熒光染料摻雜的鑭系配位聚合物顆粒為Hg2+探針的比率熒光傳感器，然而該傳感器存在探針合成步驟復(fù)雜、有機(jī)染料熒光穩(wěn)定性差等缺陷。

近年來(lái)新型熒光納米材料如碳量子點(diǎn)、硅量子點(diǎn)、金屬納米簇等地不斷涌現(xiàn)，因其具有生物相容性好、熒光光穩(wěn)定性強(qiáng)、量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，已成為構(gòu)建熒光探針的優(yōu)選材料[18-20]。本研究通過(guò)水熱法一步合成硅摻雜碳量子點(diǎn)（silicon-doped carbon quantum dots，Si-CDs），以溶菌酶（lysozyme，Lys）為配體及還原劑在堿性條件下還原氯金酸制備Lys穩(wěn)定的金納米簇（Lys-AuNCs），并以這兩種熒光材料構(gòu)建了一種能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)Hg2+的比率熒光傳感器。其原理如圖1所示，發(fā)藍(lán)色熒光的Si-CDs的熒光強(qiáng)度（I470）不受Hg2+的影響作為比率熒光傳感器的參比熒光信號(hào)；基于A(yíng)u+-Hg2+間的親金效應(yīng)，Hg2+可高效猝滅Lys-AuNCs的紅色熒光（I670），因此，以發(fā)紅色熒光的Lys-AuNCs作為比率熒光傳感器的響應(yīng)熒光信號(hào)，通過(guò)熒光強(qiáng)度比值（I670/I470）即可對(duì)Hg2+濃度實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。

圖1 比率熒光傳感器檢測(cè)Hg2＋原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the ratometric fluorescence sensor for Hg2＋ determination

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄱陽(yáng)湖湖水、超市銷(xiāo)售的屈臣氏礦泉水以及實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水。

3-氨丙基三甲氧基硅烷、氯金酸 美國(guó)西格瑪奧德里奇公司；檸檬酸、NaOH、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Lys 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MS 3 basic旋渦混勻振蕩器 德國(guó)IKA公司；SSW-600-2S電熱恒溫水槽 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SpectraMax i3x多功能微孔板檢測(cè)平臺(tái) 美國(guó)分子儀器有限公司；Tecnai 12高分辨透射電子顯微鏡 荷蘭FEI公司；ME 104電子分析天平、FE28-Standard pH酸度計(jì)德國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；Unique R10超純水凈化儀 廈門(mén)銳思捷水純化技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Lys穩(wěn)定的金納米簇的制備

參照文獻(xiàn)[21]方法合成。100 μL 10 mg/mL Lys溶液和100 μL 4 mmol/L HAuCl4溶液加到100 μL的水中混勻。大約5 min之后，加入10 μL 1 mol/L NaOH溶液，在37 ℃攪拌反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)混合物用蒸餾水透析48 h，得到棕褐色溶液即為制備完成Lys-AuNCs溶液。

1.3.2 Si-CDs的制備

為實(shí)驗(yàn)前期制備[22]，合成方法如下：量取10 mLN-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷于100 mL三頸燒瓶中，用氮?dú)饷摎? min后，加熱至240 ℃，在劇烈攪拌下迅速加入0.5 g無(wú)水檸檬酸，保持該溫度加熱1 min，最終產(chǎn)物用石油醚洗滌3 次，得到約2 mL碳量子點(diǎn)。

1.3.3 比率熒光傳感器的構(gòu)建

將合成的Si-CDs和Lys-AuNCs溶液進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋。分別取50 μL不同稀釋倍數(shù)的Si-CDs和Lys-AuNCs進(jìn)行不同濃度配比的混合，再加入200 μL的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 6.0），于室溫下充分振蕩，利用兩者在緩沖液中相互作用，構(gòu)建I670/I470約為1∶1的Si-CDs@Lys-AuNCs比率熒光探針。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

先配制質(zhì)量濃度為0、0.002、0.004、0.008、0.010、0.012、0.016 mg/L的Hg2+溶液，取100 μL不同質(zhì)量濃度Hg2+溶液、100 μL Si-CDs@Lys-AuNCs混合液與200 μL PBS（0.01 mol/L，pH 6.0）混合，室溫下靜置4 min后進(jìn)行熒光光譜測(cè)試。在370 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，設(shè)定光源激發(fā)狹縫寬與發(fā)射狹縫寬分別為9、15 nm，掃描400～750 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度變化。通過(guò)計(jì)算雙峰熒光強(qiáng)度比值與Hg2+濃度變化關(guān)系，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.5 比率熒光傳感器的選擇性

為考察其他金屬離子如Mn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+、Ba2+、Na+對(duì)比率熒光傳感器是否有干擾作用，首先，配制濃度為100 nmol/L的上述金屬離子鹽溶液及50 nmol/L的Hg2+溶液，再分別取100 μL不同金屬離子溶液、100 μL Si-CDs@Lys-AuNCs混合液與200 μL PBS（0.01 mol/L，pH 6.0）混合，室溫下充分振蕩，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，進(jìn)行熒光光譜分析。通過(guò)計(jì)算雙峰熒光強(qiáng)度比值與不同金屬離子的變化關(guān)系，判斷比率熒光傳感器對(duì)Hg2+的選擇性情況。

1.3.6 實(shí)際樣品分析

將華南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄱陽(yáng)湖湖水、屈臣氏礦泉水以及實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾后用所建立的熒光傳感器進(jìn)行測(cè)定。并向每個(gè)水樣中分別添加0.000 8、0.002、0.012 mg/L三個(gè)水平的Hg2+，用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾后用所建立的熒光傳感器進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 2017軟件繪制結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lys-AuNCs與Si-CDs的表征

如圖2A插圖所示，合成的Lys-AuNCs為深棕色溶液，在365 nm紫外燈照射下發(fā)射強(qiáng)烈紅色熒光。Lys-AuNCs分別在370 nm與500 nm左右具有兩個(gè)最佳激發(fā)峰，并且在650 nm處有一個(gè)被認(rèn)為由自由電子的帶內(nèi)躍遷所引發(fā)的近紅外發(fā)射峰[23]，這些特點(diǎn)均與報(bào)道的Lys-AuNCs的熒光光譜相符[21]。透射電鏡圖（圖2B）顯示，Lys-AuNCs在水中分散性較好，平均粒徑約2.0 nm。Si-CDs的水溶液為無(wú)色透明溶液，在365 nm紫外等照射發(fā)藍(lán)色熒光。Si-CDs的最佳激發(fā)波長(zhǎng)在370 nm左右，在此激發(fā)波長(zhǎng)下，470 nm處有1 個(gè)發(fā)射峰（圖3A）。透射電鏡圖顯示平均粒徑在2.2 nm左右，與文獻(xiàn)[22]報(bào)道相符。

圖2 Lys-AuNCs的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜圖（A）以及透射電鏡圖（B）Fig.2 Fluorescence excitation and emission spectra (A) and TEM image of Lys-AuNCs (B)

圖3 Si-CDs的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜圖（A）及透射電鏡圖（B）Fig.3 Fluorescence excitation and emission spectra (A) and TEM image of Si-CDs (B)

2.2 比率熒光傳感器可行性驗(yàn)證

由2.1節(jié)可知，Si-CDs與Lys-AuNCs均在370 nm左右有最佳激發(fā)波長(zhǎng)，這是構(gòu)建單一激發(fā)雙發(fā)射比率熒光探針的必要條件。將Si-CDs與Lys-AuNCs混合構(gòu)建熒光探針Si-CDs@Lys-AuNCs。圖4A顯示在370 nm激發(fā)下，熒光探針Si-CDs@Lys-AuNCs分別在470 nm與670 nm處具有兩個(gè)分離度很好的熒光發(fā)射峰。對(duì)Si-CDs、Lys-AuNCs及Si-CDs@Lys-AuNCs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜進(jìn)行掃描測(cè)試，發(fā)現(xiàn)Si-CDs與Lys-AuNCs混合后，Si-CDs在353 nm的特征吸收峰沒(méi)有發(fā)生紅移或藍(lán)移（圖4B）；與此同時(shí)，對(duì)Si-CDs與Lys-AuNCs混合后0、10、20、30、40 min后的熒光光譜進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)熒光光譜基本沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明Lys-AuNCs和Si-CDs之間沒(méi)有發(fā)生反應(yīng)或相互作用（圖4C）。將熒光探針Si-CDs@Lys-AuNCs與不同質(zhì)量濃度Hg2+相互作用，結(jié)果如圖4D所示，隸屬于Si-CDs在470 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度在不同Hg2+質(zhì)量濃度下保持穩(wěn)定，因此，470 nm的熒光信號(hào)可作為比率熒光傳感器的參比信號(hào)；而隸屬于Lys-AuNCs在670 nm的發(fā)射峰強(qiáng)度隨著Hg2+質(zhì)量濃度升高而逐漸減弱。Hg2+對(duì)金納米簇?zé)晒忖鐧C(jī)理已有報(bào)道：Xie Jianping等[24]發(fā)現(xiàn)由于Hg2+與Au+之間的高親和嗜金屬效應(yīng)，Hg2+可以顯著猝滅牛血清蛋白穩(wěn)定的金納米簇（BSA-AuNCs）的熒光。綜上可知，基于Si-CDs與Lys-AuNCs構(gòu)建檢測(cè)Hg2+的比率熒光傳感器完全可行。

圖4 Si-CDs@Lys-AuNCs的熒光光譜和紫外-可見(jiàn)光譜Fig.4 Fluorescence emission spectra and UV-vis absorption spectra of Si-CDs@Lys-AuNCs

2.3 比率熒光傳感器的優(yōu)化

為保證傳感器的最佳檢測(cè)性能，對(duì)傳感體系所處的pH值、反應(yīng)時(shí)間對(duì)Hg2+檢測(cè)的影響進(jìn)行探究。采樣不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的PBS（0.01 mol/L）作為基底溶液進(jìn)行Hg2+測(cè)定實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)加入Hg2+前后體系的比率熒光信號(hào)（I670/I470）進(jìn)行采集。圖5A顯示，當(dāng)不存在Hg2+時(shí)，體系的I670/I470值比較穩(wěn)定受pH值的影響較小。在加入Hg2+后，由于Hg2+對(duì)Lys-AuNCs的熒光猝滅作用，體系的I670/I470值均會(huì)減小，但是在pH值偏堿性時(shí)（pH＞7.0），Hg2+由于易生產(chǎn)沉淀對(duì)Lys-AuNCs猝滅效果明顯減弱導(dǎo)致I670/I470值在Hg2+加入前后的降低幅度減小，從而影響檢測(cè)靈敏度。當(dāng)pH值為6.0時(shí)，比率熒光信號(hào)在Hg2+加入后降低幅度最大，因此，選擇pH 6.0的PBS作為該傳感體系的基底緩沖液。

圖5 加入Hg2＋（50 nmol/L）后pH值（A）和反應(yīng)時(shí)間（B）對(duì)體系比率熒光信號(hào)變化的影響Fig.5 Effect of buffer pH (A) and reaction time (B) on variation in ratiometric fluorescence signal after the addition of Hg2+ (50 nmol/L)

與此同時(shí)，為保證在最短時(shí)間對(duì)Hg2+進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。將Hg2+與比率熒光探針Si-CDs@Lys-AuNCs混合后，記錄體系的I670/I470值隨作用時(shí)間變化情況。由圖5B可知，Hg2+加入后的4 min以?xún)?nèi)，體系的I670/I470值隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，說(shuō)明Hg2+在與熒光探針?lè)磻?yīng)，猝滅Lys-AuNCs；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)4 min，體系的I670/I470值基本趨于穩(wěn)定，說(shuō)明反應(yīng)基本完成。因此，選擇4 min作為最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與檢出限

在最優(yōu)條件下，將不同質(zhì)量濃度的Hg2+（0、0.002、0.004、0.008、0.010、0.012、0.016 mg/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液與比率熒光探針Si-CDs@Lys-AuNCs混合，通過(guò)熒光光譜儀記錄熒光發(fā)射光譜，計(jì)算I670/I470值并建立其與Hg2+質(zhì)量濃度關(guān)系。圖6A顯示，隨Hg2+質(zhì)量濃度的增加，470 nm波長(zhǎng)處Si-CDs的藍(lán)色熒光強(qiáng)度（I470）不隨Hg2+質(zhì)量濃度的變化而變化，而670 nm波長(zhǎng)處Lys-AuNC的紅色熒光強(qiáng)度（I670）隨Hg2+質(zhì)量濃度的增加而逐漸減弱。同等條件下的基于單一熒光信號(hào)測(cè)定的傳感器與比率熒光傳感器比較，單一熒光信號(hào)的傳感器易受外界溫度、濃度、pH值、激發(fā)強(qiáng)度等眾多難以控制因素的干擾；而比率熒光信號(hào)傳感器因其自帶內(nèi)標(biāo)，通過(guò)兩峰熒光強(qiáng)度的比值作為因變量，可極大地削弱其他干擾因素的影響，使得對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)更加精確、更加靈敏。圖6B顯示，I670/I470與Hg2+質(zhì)量濃度在0～0.016 mg/L范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性關(guān)系式為I670/I470= 1.35-64.18C（Hg2+），R2=0.999，計(jì)算檢出限（3σ）為0.001 mg/L，σ為20 次空白測(cè)定信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。與已報(bào)道的Hg2+檢測(cè)方法比較（表1），可以看到本研究建立的傳感器具有較好的靈敏度。

表1 不同方法對(duì)Hg2＋的檢測(cè)性能比較Table 1 Comparsion of figures of merit of different Hg2+ detection methods

圖6 比率熒光傳感器對(duì)不同質(zhì)量濃度Hg2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液（0～0.016 mg/L）熒光光譜的響應(yīng)（A）和比率熒光信號(hào)與Hg2＋質(zhì)量濃度關(guān)系圖（B）Fig.6 Fluorescence emission spectra of the sensor in the presence of various concentrations of Hg2+ (from 0 to 0.016 mg/L) (A) and linear plot of (I670/I470) versus Hg2+ concentration (B)

2.5 比率熒光傳感器對(duì)Hg2+的選擇性

探究比率熒光傳感器對(duì)其他金屬離子與Hg2+的響應(yīng)情況，以便考察比率熒光傳感器對(duì)Hg2+的選擇性。如圖7所示，在其他實(shí)驗(yàn)相同條件下，選擇100 nmol/L Mn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+、Ba2+、Na+以及無(wú)金屬離子的空白組與50 nmol/L Hg2+進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)濃度僅為50 nmol/L的Hg2+能明顯猝滅670 nm波長(zhǎng)處Lys-AuNCs的熒光峰值。濃度更高的其他金屬離子（100 nmol/L）與空白組響應(yīng)情況相接近，猝滅670 nm波長(zhǎng)處的熒光能力較弱。由此可說(shuō)明，其他金屬離子對(duì)該傳感器檢測(cè)Hg2+的影響很小，即本研究所建立的比率熒光傳感器對(duì)Hg2+具有較好的選擇性。

圖7 比率熒光傳感器對(duì)不同金屬離子的選擇性（50 nmol/L Hg2＋和100 nmol/L其他金屬離子）熒光光譜圖（A）及比率熒光信號(hào)響應(yīng)情況（B）Fig.7 Fluorescence emission spectra of the sensor (A) and I670/I470 values observed (B) in the presence of 50 nmol/L of Hg2+ or 100 nmol/L of different other metal ions

2.6 實(shí)際樣品中Hg2+的檢測(cè)

為考察所建立比率熒光傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的準(zhǔn)確性，分別選取湖水、自來(lái)水、礦泉水為實(shí)際樣品，探究該比率熒光傳感器對(duì)這些樣品中Hg2+的響應(yīng)情況。將Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液添加前后的水樣經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理分別用所建立的比率熒光傳感器進(jìn)行測(cè)定。如表2所示，該傳感器在3 種實(shí)際水樣中也能對(duì)Hg2+產(chǎn)生準(zhǔn)確、靈敏的響應(yīng)，回收率在94.3%～115.0%之間，變異系數(shù)不大于10.3%，表明本研究所建立的Hg2+比率熒光傳感器可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表2 實(shí)際樣品中Hg2＋的檢測(cè)結(jié)果與加標(biāo)回收率（n=3）Table 2 Recoveries of Hg2+ spiked in different water samples (n = 3)

3 結(jié) 論

本研究利用對(duì)Hg2+穩(wěn)定的Si-CDs和對(duì)Hg2+敏感響應(yīng)的Lys-AuNCs分別作為參比熒光團(tuán)與響應(yīng)熒光團(tuán)，構(gòu)建了一種單一激發(fā)雙發(fā)射的比率熒光探針實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、靈敏地對(duì)Hg2+進(jìn)行測(cè)定。在最優(yōu)條件下，檢測(cè)線(xiàn)性范圍為0～0.016 mg/L，檢出限為0.001 mg/L。GB 2762—2017《食品中污染物限量本標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定飲用水中汞限量為0.001 mg/L，因此，該感器的靈敏度滿(mǎn)足國(guó)標(biāo)限量標(biāo)準(zhǔn)的需求。在實(shí)際湖水、自來(lái)水、礦泉水3 種水樣的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率范圍在94.3%～115.0%之間。綜上可知，本研究所建立Hg2+比率熒光傳感器具有較好的檢測(cè)性能與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。