基于酸度控制的吸收光譜法測定飲料中共存的檸檬黃和日落黃

江 虹，龐向東，蔣 翠，冉紅杰，付 玲，劉 璐

（長江師范學院化學化工學院，重慶 408100）

食品中常用色素分為天然色素和合成色素兩大類，合成色素具有價廉、色鮮且不易褪色的優點，在食品工業中得到廣泛應用。但合成色素若食用過多，會對人體產生一定的不安全性或危害性（如頭痛、腹瀉、哮喘、過敏甚至致癌等），因此，對食品中合成色素進行研究有著重要意義。為了保障人們的身體健康及飲食安全，GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中對添加劑的使用作出專項的限量規定，明確指出，飲料中檸檬黃和日落黃的加入量不得超過0.10 g/kg，可見，建立快速、簡便檢測食品中共存色素的方法具有重要的研究意義。近年來，國內外對檸檬黃和日落黃的檢測研究主要有電化學法[1-9]、高效液相色譜法[10-16]、高效薄層色譜法[17]、熒光法[18]及分光光度法[19-26]等，GB 5009.35—2016《食品中合成著色劑的測定》采用高效液相色譜法，這些方法通常需對共存色素進行吸附分離處理后進行測定，操作較為復雜。所報道的分光光度法除用較復雜的吸附分離處理外，還可根據吸收曲線的重疊情況采用較復雜的解聯立方程組的辦法解決共存色素的含量檢測問題[23-26]。本實驗以乙基紫作為探針，采用控制酸度的吸收光譜法研究飲料中共存色素——檸檬黃與日落黃的含量問題，此法不需分離，只需在同一體系中控制溶液酸度，便可直接測定共存的檸檬黃和日落黃。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飲料：橙味、蘋果味、香蕉味、檸檬味、橙味、蘇打味、橙蜜味、橙味、橙汁、青檸汁（編號依次為1#～10#），均購自本地超市。

檸檬黃標準物質（≥98%，Lot：A3J6L1）、日落黃標準物質（≥98%，Lot：JN1103RA14）均為北京盛世康普化工技術研究院生產，由北京普析科技有限公司提供。

乙基紫（分析純） 成都艾科達化學試劑有限公司；鹽酸（HCl）、氨水（NH3·H2O）（均為分析純） 重慶川東化工（集團）有限公司；氨丁三醇（Tris）（分析純）河南天孚化工有限公司；實驗用水為自制超純水。

1.2 儀器與設備

U-3010型紫外-可見分光光度計 日本日立公司；KQ-200VDE型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C型酸度計 上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

檸檬黃、日落黃標準溶液：分別準確稱取一定量的檸檬黃和日落黃標準物質（精確至±0.000 1 g），用水溶解并分別定容至250 mL，配成1.00×10-3mol/L貯備液，操作液為1.00×10-4mol/L，存于4 ℃冰箱中；乙基紫溶液：準確稱取適量乙基紫，用水溶解并定容至500 mL，配成1.00×10-3mol/L；HCl溶液：0.10 mol/L；Tris溶液：0.20 mol/L；Tris-HCl溶液：用酸度計測定，配成pH 3.5～9.5。

1.3.2 樣品處理

精密移取1#～10#飲料各30.0 mL，并準確稱其質量（精確至±0.000 1 g），分別置于小燒杯中，45 ℃超聲20 min，加適量水，攪拌，再超聲10 min，用NH3·H2O調至中性，再超聲10 min，取出，冷至室溫，定量轉移至100 mL容量瓶中，用水定容。

1.3.3 實驗方法

精密移取適量檸檬黃（或日落黃）標準溶液，置于10 mL具塞比色管中，加入1.00 mL pH 5.69 Tris-HCl溶液（檸檬黃體系）和1.00 mL pH 8.68 Tris-HCl溶液（日落黃體系），再各加入2.00 mL乙基紫溶液，用水定容至10 mL，搖勻，待反應10 min后，以試劑空白作參比，在波長506 nm處測定檸檬黃體系溶液的吸光度，在波長646 nm處測定日落黃體系溶液的吸光度。

1.4 數據處理

采用Excel軟件進行數據統計，Origin軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 吸收光譜特征

反應機理：乙基紫是一種三苯甲烷類的堿性染料，在溶液中以陽離子形式存在；檸檬黃結構上有磺酸根離子和羧酸根離子，日落黃結構上有磺酸根離子，在溶液中Na+離去后，均以陰離子形式存于溶液中；于是陰、陽離子以靜電引力相作用分別生成乙基紫-檸檬黃和乙基紫-日落黃的二元離子締合物，其體系吸收光譜見表1。

表1 檸檬黃-乙基紫體系與日落黃-乙基紫體系在不同酸度下的吸收光譜特征Table 1 Absorption spectral characteristics of tartrazine-ethyl violet system and sunset yellow-ethyl violet system under different acidities

從圖1A可知，單獨的檸檬黃溶液和單獨的日落黃溶液分別在波長426 nm和480 nm處有一較大的吸收峰（曲線1和曲線2），兩曲線間有重疊（即相互間有干擾），因此不能直接分別測定2 種物質的含量。

圖1 檸檬黃-乙基紫體系與日落黃-乙基紫體系的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of tartrazine-ethyl violet system and sunset yellow-ethyl violet system

如果在檸檬黃和日落黃的pH 5.69 Tris-HCl溶液中加入乙基紫溶液，乙基紫與檸檬黃和日落黃均可以靜電引力結合生成離子締合物，在光譜曲線上出現具有多個特征吸收峰的新光譜，圖1A中曲線4和曲線5，與曲線3的吸收峰（594 nm）比較，曲線4和曲線5均有波移現象，這說明乙基紫與檸檬黃和日落黃均可反應生成新物質。再比較曲線4和曲線5可知，檸檬黃體系在酸性條件（pH 5.69）下波長506 nm處有一較大的負吸收峰，而日落黃在此處的吸收幾乎近于0；檸檬黃體系在波長420 nm和波長655 nm處分別還有一較大的正吸收峰，但日落黃在此兩波長下也有較大吸收；故可選擇在波長506 nm處測定檸檬黃，日落黃不干擾。日落黃體系在pH 5.69酸性條件下，雖有較大特征吸收峰，但檸檬黃也有較大吸收，對其干擾嚴重，因此在酸性條件下不能單獨測定共存的日落黃。

由圖1B可知，在pH 8.68 Tris-HCl條件下，乙基紫可與檸檬黃和日落黃反應，檸檬黃體系出現2 個較大的負吸收峰（曲線2），日落黃體系出現1 個較大的正吸收峰（曲線1）。比較曲線1和曲線2可知，在此弱堿性條件下，均不能在波長496 nm和波長626 nm處單獨測定檸檬黃（日落黃有干擾），但可以在波長646 nm處單獨測定日落黃（檸檬黃的吸光度近于0，不干擾日落黃的測定）。

從圖1C可知，在波長506 nm處，檸檬黃在一定范圍內的質量濃度與體系的負吸光強度有良好的線性關系，可用于檸檬黃的定量分析。從圖1D可知，在波長646 nm處，日落黃在一定范圍內的質量濃度與體系吸光度也有良好的線性關系，可用于日落黃的定量分析。故可以在波長506 nm處，pH 5.69 Tris-HCl條件下，單獨測定共存的檸檬黃（日落黃不干擾）；在波長646 nm處，pH 8.68 Tris-HCl條件下，單獨測定共存的日落黃（檸檬黃不干擾）。

2.2 適宜條件的選擇

2.2.1 溶液酸度及用量

考察檸檬黃、日落黃標準操作液為1.00 mL，乙基紫溶液為2.00 mL時，1.00 mL不同pH值的Tris-HCl溶液對波長506 nm和波長646 nm處的檸檬黃-乙基紫體系與日落黃-乙基紫體系吸光度絕對值（|A|）的影響，見圖2。可知，在波長506 nm及pH 5.69的Tris-HCl條件下，檸檬黃體系有相對最大的|A|（曲線1），日落黃體系的|A|近于0（曲線2），即在pH 5.69條件下，可以在波長506 nm處測定檸檬黃，日落黃不干擾；在波長646 nm及pH 8.68 Tris-HCl條件下，檸檬黃體系的|A|近于0（曲線4），而日落黃體系則有相對最大的|A|（曲線3），即在pH 8.68 條件下，可以在波長646 nm 處測定日落黃，檸檬黃不干擾。同時考察pH 5.69和pH 8.68的用量對各體系|A|的影響，結果表明，最適宜的用量均為1.00 mL。實驗選用1.00 mL pH 5.69 Tris-HCl（檸檬黃體系）和1.00 mL pH 8.68 Tris-HCl（日落黃體系）分別在波長506 nm測定檸檬黃和在波長646 nm測定日落黃。

圖2 溶液pH值對吸光度絕對值的影響Fig.2 Effect of solution pH on absolute absorbance value

2.2.2 乙基紫溶液的用量

考察檸檬黃、日落黃標準操作液為1.00 mL，pH 5.69（檸檬黃體系）和pH 8.68（日落黃體系）Tris-HCl溶液1.00 mL時，乙基紫溶液用量對波長506 nm處的檸檬黃體系和波長646 nm處的日落黃體系|A|的影響，見圖3。兩體系的乙基紫溶液用量為2.00 mL時，體系|A|相對最大，大于或小于2.00 mL，|A|有不同程度降低（表明乙基紫加入不夠使反應不完全，或乙基紫加入過量，使自身聚集增強，從而導致|A|降低），故實驗選用乙基紫的適宜用量為2.00 mL。

圖3 乙基紫用量對吸光度絕對值的影響Fig.3 Effect of ethyl violet dosage on absolute absorbance value

2.2.3 反應時間及締合物的穩定性

在上述選定的條件下，考察5～80 min對檸檬黃體系（506 nm，pH 5.69）及日落黃體系（646 nm，pH 8.68）對|A|的影響。結果表明：兩體系在10 min內均可反應完全，生成締合物的穩定時間至少1 h。故兩體系的測定時間選在10 min后的穩定區進行。

2.3 標準曲線及靈敏度

準確移取0.00、0.20、0.60、1.00、1.40、1.80 mL 1.00×10-4mol/L檸檬黃標準溶液和0.00、0.20、0.60、1.00、1.40 mL 1.00×10-4mol/L日落黃標準溶液，按實驗方法加入其他試劑溶液并用水定容，在選定時間及各體系波長下測定各溶液的吸光度。標準曲線及相關參數見表2。可見，該方法有較高靈敏度，可用于檸檬黃和日落黃的定量分析。

表2 日落黃和檸檬黃的標準曲線相關參數Table 2 Analytical figures of merit of absorption spectrometry for determination of sunset yellow and tartrazine

2.4 方法的選擇性

考察波長506 nm處的檸檬黃體系（pH 5.69）和波長646 nm處的日落黃體系（pH 8.68）在相對誤差不大于±5%時，某些共存物對檸檬黃（5.34 mg/L）及日落黃（4.52 mg/L）測定的影響。結果表明：100 倍的K+、Na+、NH4+、NO3-、Cl-、葡萄糖、蔗糖、甜蜜素、安賽蜜、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、D-蘇氨酸、L-谷氨酸；50 倍的麥芽糖、D-果糖、D-色氨酸、L-白氨酸、甘氨酸、檸檬酸三鈉、抗壞血酸、姜黃素、誘惑紅；20 倍的Ba2+、Sr2+、Fe2+、Sn2+、Pb2+、Ca2+、Mg2+、C2O42-、CO32-、尿素、淀粉、胭脂紅、赤蘚紅；3 倍的Fe3+、Al3+等不干擾測定。可見，檸檬黃體系和日落黃體系均有良好的選擇性。

2.5 樣品分析及加標回收實驗

2.5.1 樣液測定

取1.3.2節的1#～10#待測液各2.00 mL，按實驗方法加入乙基紫溶液和各體系最佳酸度的Tris-HCl溶液（檸檬黃體系pH 5.65，日落黃體系pH 8.68），在波長506 nm處測定樣液中檸檬黃含量，在波長646 nm處測定樣液中日落黃含量，最后求出原始飲料中共存的檸檬黃和日落黃含量，并參考文獻[23-26]和GB 5009.35—2016作對照實驗，結果表明，其準確度和精密度均無顯著性差異，本法與國標法的顯著性檢驗結果見表3。

表3 飲料樣品分析結果（n=5）Table 3 Comparison of results of absorption spectrometry and the national standard method for sunset yellow and tartrazine in beverage samples (n = 5)

2.5.2 回收實驗結果

準確移取1#～10#飲料各30.0 mL并準確稱量后分別置于小燒杯中，準確加入一定量的檸檬黃和日落黃標準貯備液，在45 ℃超聲20 min，后續操作同樣液的制備，最后轉移至100 mL容量瓶中，用水定容。取該液2.00 mL，按實驗方法測定各加標回收率，見表4。結果表明，方法有較高的準確度和精密度。

表4 飲料樣品的加標回收實驗（n=5）Table 4 Spiked recoveries of sunset yellow and tartrazine in beverage samples (n = 5)

續表4

3 結 論

建立乙基紫作為探針測定共存色素——檸檬黃和日落黃含量的酸度控制吸收光譜法，簡便、快速，無需分離和進行復雜的數學處理，只需控制溶液酸度，便可達到分別測定共存物檸檬黃和日落黃的目的。方法有較高靈敏度、較寬線性范圍和良好的選擇性，準確度和精密度滿足定量分析要求。該法適于飲料中共存檸檬黃和日落黃的定量分析。