Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜技術(shù)分析鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白肽指紋圖譜的差異性

徐明芳，鄭春麗，王洋洋，白衛(wèi)濱*，葉 蕾，崔 靜

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632）

魚(yú)類肌肉蛋白質(zhì)是多種蛋白的復(fù)合體，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)18%～22%以上，根據(jù)溶解性的不同，魚(yú)肉中的蛋白質(zhì)可以分為3 大類：高鹽溶解蛋白如肌原纖維蛋白（55%～60%）、低鹽溶解的肌漿蛋白（25%～35%）和不溶性基質(zhì)蛋白（10%～15%）。其中，肌原纖維蛋白約占魚(yú)類總蛋白含量的55%～60%，是魚(yú)肌肉中含量最高的蛋白質(zhì)，主要包括肌球蛋白（50%～55%）、肌動(dòng)蛋白（20%～25%）、原肌球蛋白（5%～10%）和肌鈣蛋白（5%～10%）4 個(gè)主要蛋白組分[1-2]。肌動(dòng)蛋白存在于所有真核細(xì)胞中，肌動(dòng)蛋白在真核細(xì)胞進(jìn)化過(guò)程中相當(dāng)保守[3-4]，低等真核生物（例如酵母）只含有一種肌動(dòng)蛋白，而多細(xì)胞生物通常含有多種肌動(dòng)蛋白亞型，在哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類細(xì)胞中至少有6 種肌動(dòng)蛋白異構(gòu)體由不同的基因編碼，已分離到6 種肌動(dòng)蛋白[5]，4 種稱為α-肌動(dòng)蛋白，分別為橫紋?。ê趋兰。?、心肌、血管平滑肌和腸道平滑肌所特有，另2 種為β-肌動(dòng)蛋白和γ-肌動(dòng)蛋白，見(jiàn)于所有肌肉細(xì)胞和非肌肉細(xì)胞質(zhì)中[6]。

如圖1[7]所示，肌動(dòng)蛋白是一種高度豐富的細(xì)胞內(nèi)蛋白，存在于每個(gè)真核細(xì)胞中，以單體G-肌動(dòng)蛋白和多聚體F-肌動(dòng)蛋白2 種形式存在，是細(xì)胞骨架的關(guān)鍵組成部分[8]。肌動(dòng)蛋白的多聚體構(gòu)成右螺旋的四級(jí)結(jié)構(gòu)即纖維狀[9-10]，主要功能是聚合成細(xì)絲的能力，細(xì)絲在細(xì)胞黏附、機(jī)械收縮、定向遷移、肌肉收縮、細(xì)胞分裂和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)然具^(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。在非肌細(xì)胞中，肌動(dòng)蛋白G-肌動(dòng)蛋白和F-肌動(dòng)蛋白形式之間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞分裂[11]、黏附、運(yùn)動(dòng)和物質(zhì)運(yùn)輸，除細(xì)胞骨架功能外，肌動(dòng)蛋白可通過(guò)核輸入直接結(jié)合在許多基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[12]；肌動(dòng)蛋白也與某些疾病的發(fā)生密切相關(guān)，例如阿爾茨海默病[13-14]及心肌病[15-16]，此外肌動(dòng)蛋白還與衰老相關(guān)[17]，對(duì)維持心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的正常功能具有重要作用[18-20]。肌動(dòng)蛋白的研究最早可追溯到19世紀(jì)，自肌動(dòng)蛋白被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，對(duì)肌動(dòng)蛋白的研究主要以兔[21]、牛[22]、小鼠[23]等哺乳動(dòng)物為主，在進(jìn)化過(guò)程中，肌動(dòng)蛋白在蛋白質(zhì)水平上高度保守，各種生物間氨基酸序列的同源性高達(dá)70%以上，但魚(yú)類肌動(dòng)蛋白的研究文獻(xiàn)鮮有報(bào)道，魚(yú)類肌動(dòng)蛋白是否具有更高同源性及氨基酸序列的差異性值得深入研究。

圖1 G-肌動(dòng)蛋白（a）和F-肌動(dòng)蛋白（b）的結(jié)構(gòu)[7]Fig.1 Structures of G-actin (a) and F-actin (b)

肽質(zhì)量指紋譜分析，簡(jiǎn)稱肽質(zhì)指紋圖譜，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)中鑒定蛋白真實(shí)性的高通量分析方法。在蛋白質(zhì)肽質(zhì)指紋圖譜研究中，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是常用的分析工具。質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀分析鑒定的關(guān)鍵核心部件，目前最常用的質(zhì)量分析器有四極桿、TOF、離子阱、靜電場(chǎng)軌道阱（Orbitrap）等，不同類型的質(zhì)量分析器組合會(huì)構(gòu)成不同功能的質(zhì)譜儀，近年發(fā)展二維線性離子阱組合型傅里葉轉(zhuǎn)換質(zhì)譜（linear trap quadropole orbitrap mass spectrometry，LTQ Orbitrap MS），因其高分辨能力，在特征肽段、未知蛋白的鑒定和差異蛋白質(zhì)組的研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。Orbitrap質(zhì)譜儀器最高分辨率可達(dá)100 000，檢測(cè)到亞10-6級(jí)，而TOF質(zhì)譜儀分辨率小于3 000[24]。徐明芳等[25-26]利用LTQ Orbitrap MS質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定不同奶牛品種乳源如南方水牛奶、荷斯坦牛奶和山羊奶乳清蛋白的特征肽段與精細(xì)結(jié)構(gòu)，研究了南方水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要組分肽質(zhì)指紋圖譜及氨基酸序列差異性，為乳源蛋白真實(shí)性檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展提供依據(jù)。Feng Jixing等[27]利用MALDI-TOF-MS分析南美白對(duì)蝦45 kDa蛋白的酶解肽段，鑒定為45 kDa蛋白屬于β-肌動(dòng)蛋白，氨基酸序列覆蓋率為28%。近年質(zhì)譜儀在儀器靈敏度，質(zhì)量分辨率和掃描速度方面又有新的突破，Orbitrap Fusion Lumos三合一高分辨質(zhì)譜儀是目前最新型質(zhì)譜儀，如圖2所示。

圖2 Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜儀Fig.2 Structure of Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer

三合一質(zhì)譜儀整合了四極桿質(zhì)量過(guò)濾器、超高靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)量分析器與線性離子阱質(zhì)量分析器三位一體同時(shí)運(yùn)行，極大提高了離子采集精度與速度，與上一代LTQ Orbitrap MS相比對(duì)低至2 ng的蛋白質(zhì)組樣品的肽段鑒定率增加了3 倍[28]，非常適合蛋白質(zhì)組學(xué)中復(fù)雜體系的高通量蛋白檢測(cè)。Sathe等[29]采用Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜儀對(duì)腦脊液樣品鑒定了111 個(gè)磷酸酪氨酸肽段及對(duì)應(yīng)66 個(gè)蛋白，三合一質(zhì)譜儀因其高靈敏度、高質(zhì)量精確度、超高分辨率和掃描速度的優(yōu)勢(shì)倍受關(guān)注，但該技術(shù)用于魚(yú)類肌動(dòng)蛋白的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究將采用Orbitrap FusionTMMS四極桿質(zhì)量過(guò)濾器-靜電場(chǎng)軌道阱-線性離子阱三合一高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)名貴魚(yú)類肌動(dòng)蛋白進(jìn)行鑒定，通過(guò)對(duì)其特征肽段與氨基酸序列差異性進(jìn)行分析，建立肌動(dòng)蛋白肽質(zhì)量指紋圖譜，以期為魚(yú)類蛋白真實(shí)性及品質(zhì)屬性鑒定提供技術(shù)方法，為開(kāi)拓肌動(dòng)蛋白在疾病與健康領(lǐng)域的應(yīng)用研究及魚(yú)類蛋白功能食品研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鱖魚(yú)（866±111）g、金鯧魚(yú)（700±28）g和鱘魚(yú)（1 486±98）g購(gòu)自暨南大學(xué)菜市場(chǎng)。

碳酸氫銨、乙腈、三氟乙酸、二硫蘇糖醇、吲哚-3-乙酸、胰蛋白酶均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜儀、Pico17型微型合成離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 待測(cè)樣品凍干粉的制備

肌原纖維蛋白的制備參照Lv Mingchun等[30]的方法，有所修改。取魚(yú)肌肉組織50 g破碎，加入5 倍體積緩沖液A，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)3～4 次，洗去水溶性蛋白質(zhì)。取沉淀，沉淀加入10 倍體積緩沖液B，攪拌混勻，于4 ℃靜置1 h，10 000 r/min離心10 min，得到的上清液即肌原纖維蛋白溶液。

雙水相法制備魚(yú)肌動(dòng)蛋白凍干粉參照王洋洋等[31]的方法，在異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%，pH 9.0條件下，制備5 L雙水相體系萃取分離體系，肌原纖維蛋白加入量為體系總質(zhì)量的30%，室溫靜置3 h后分離出上相經(jīng)過(guò)35 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20 min，4 ℃靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，蒸餾水透析去鹽，真空冷凍干燥得到肌動(dòng)蛋白凍干粉存4 ℃保存。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

各稱取1.0 mg凍干粉于1.5 mL離心管中，加入1 mL樣品緩沖液，充分溶解后，沸水浴加熱5 min，冷卻后加樣。參照Laemmli[32]的電泳方法，分離膠10%，濃縮膠5%，電極緩沖液含0.05 mol/L三羥甲基氨基甲烷，0.384 mol/L甘氨酸，0.1%十二烷基硫酸鈉。上樣量為15 μL；開(kāi)始電泳時(shí)濃縮膠電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后電壓改為120 V。電泳結(jié)束后，取出膠片用考馬斯亮藍(lán)染色，用無(wú)水乙醇/冰醋酸脫色至背景清晰。

1.3.3 蛋白膠內(nèi)酶解

將獲得的鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠酶解，酶解方法與實(shí)施步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[33]。

1.3.4 試劑配制方法

10 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液：79.06 mg碳酸氫銨溶于超純水中，定容到10 mL。1 mL脫色液：0.5 mL 100%乙腈，0.25 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液，0.25 mL ddH2O。4 mL還原劑：6.2 mg二硫蘇糖醇，1 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液，3 mL dd H2O。4 mL烷基化試劑：40.69 mg吲哚-3-乙酸，1 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液，3 mL ddH2O。2 mL覆蓋液：0.5 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液，0.2 mL 100%乙腈，1.3 mL ddH2O。酶液儲(chǔ)液：1 mg/mL胰蛋白酶用覆蓋液稀釋至0.02 μg/μL。3 mL萃取液：0.075 mL三氟乙酸，2.01 mL 100%乙腈，0.915 mL dd H2O。1 mL樣品溶解液：0.001 mL甲酸，0.02 mL 100%乙腈，0.979 mL dd H2O。

1.3.5 質(zhì)譜檢測(cè)

凍干的樣品脫鹽后，加入12 μL樣品溶解液，充分振蕩渦旋，離心，取10 μL上清液用Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜分析。樣品經(jīng)C18反相柱（100 mm×75 μm，3 μm）分離，肽段在反相柱上洗脫梯度為5%～100%乙腈（含0.1%甲酸）洗脫30 min，流速為600 nL/min。

質(zhì)譜條件：一級(jí)質(zhì)譜的Orbitrap分辨率為60 000，質(zhì)量掃描范圍m/z350～1 500，最大注入時(shí)間為50 ms；二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)器類型Orbitrap，分辨率15 000，使用HCD模式碰撞裂解，碰撞能量31%，最大注入時(shí)間為100 ms。

1.3.6 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與分析方法

根據(jù)樣品物種來(lái)源從UniProt下載對(duì)應(yīng)物種的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)分析使用Xcalibur、MaxQuant等軟件?；谲浖凶詭惴ㄅc圖片可視化功能，根據(jù)設(shè)定參數(shù)將液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)得到的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，通過(guò)肽段的一級(jí)和二級(jí)碎片的質(zhì)量在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到匹配的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)樣品中的蛋白質(zhì)鑒定。

質(zhì)譜得到原始數(shù)據(jù)為Raw格式，下載MSFileReader_x86_x64-_3.exe讀數(shù)軟件，打開(kāi)Xcalibur軟件與MaxQuant 1.6.0.16軟件起始界面，用搜庫(kù)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，分別在鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（2019年11月15日下載自NCBI Protein數(shù)據(jù)庫(kù)，以Siniperca chuatsi、Trachinotus ovatus和Acipenser sinensis為名，搜索結(jié)果分別包含5 186、5 893 條和235 條序列中搜索MS/MS質(zhì)譜。

以鱖魚(yú)為例，鱖魚(yú)質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)（Raw文件）通過(guò)讀數(shù)軟件MSFileReader_x86_x64-_3.exe后導(dǎo)入MaxQuant 1.6.0.16軟件或Xcalibur軟件中，組特定參數(shù)（groupspecific parameters）Digestion設(shè)置為Trypsin，全局參數(shù)（global parameters）設(shè)置S.chuatsisequence.fasta數(shù)據(jù)庫(kù)，執(zhí)行搜庫(kù)功能，通過(guò)樣品質(zhì)譜中每個(gè)m/z信號(hào)與數(shù)據(jù)庫(kù)肽質(zhì)量列表進(jìn)行匹配并對(duì)整個(gè)肽段列表進(jìn)行排序，在質(zhì)量容差范圍內(nèi)的所有匹配項(xiàng)將用于計(jì)算分?jǐn)?shù)和鑒定相應(yīng)的蛋白質(zhì)。

搜索參數(shù)設(shè)置：數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBInr，酶為胰蛋白酶，允許最大漏切位點(diǎn)為1，固定修飾為Carbamidomethyl(C)，可變修飾為Oxidation(M)，MS tolerance（容差）為0.15 Da，MS/MS tolerance為0.25 Da，其他參數(shù)均為軟件默認(rèn)值。在Xcalibur4.0軟件平臺(tái)或MaxQuant軟件的可視化窗口下（Viewer）處理一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜圖。搜庫(kù)結(jié)果以combined-txt文件夾形式保存，combined-txt文件夾包含所有鑒定和定量的全部結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌動(dòng)蛋白的一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜

鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解的多肽混合物分別經(jīng)Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜檢測(cè)，采用Xcalibur軟件與MaxQuant軟件在可視化窗口下運(yùn)行，獲得蛋白質(zhì)樣品的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖，如圖3所示。軟件分析得到鱖魚(yú)二級(jí)質(zhì)譜肽段數(shù)量249 個(gè)，金鯧魚(yú)二級(jí)質(zhì)譜肽段數(shù)量164 個(gè)，鱘魚(yú)二級(jí)質(zhì)譜肽段數(shù)量141 個(gè)，共計(jì)554 個(gè)肽段，基于篇幅，無(wú)法一一展示所有肽段，每種魚(yú)類僅選取2 個(gè)特征肽段二級(jí)質(zhì)譜如圖4所示，由二級(jí)質(zhì)譜離子峰匹配出相應(yīng)氨基酸序列。

圖3 3 種魚(yú)肌動(dòng)蛋白一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 Primary mass spectra of actin from three fish species

圖4 3 種魚(yú)肌動(dòng)蛋白特征肽段二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary mass spectra of signature actin peptides from three fish species

2.2 鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白質(zhì)譜差異性

鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白的多肽混合物分別經(jīng)Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜分析。質(zhì)譜得到肽段信息用MaxQuant 1.6.0.16搜庫(kù)軟件分別在鱖魚(yú)、鱘魚(yú)和金鯧魚(yú)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，根據(jù)得分、匹配的肽段數(shù)、特征肽段數(shù)和覆蓋率等綜合評(píng)判鑒定出肽段氨基酸序列、肽段來(lái)源及所屬蛋白的氨基酸全序列。蛋白鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白質(zhì)譜差異性Table 1 Differences in actin mass spectra among S.chuatsi,T.ovatus and A.sinensis

MS/MS產(chǎn)生的碎片信息搜庫(kù)后會(huì)鑒定出氨基酸序列和所屬的蛋白種類，并且肽段對(duì)于所屬蛋白來(lái)說(shuō)是否為特征肽段，質(zhì)譜鑒定結(jié)果會(huì)直接告知。僅根據(jù)每種魚(yú)類的特征肽段不足以鑒定蛋白，而是通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的所有肽段搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)質(zhì)譜鑒定到蛋白的肽段覆蓋率、得分、匹配的肽段數(shù)、特征肽段數(shù)等參數(shù)綜合評(píng)判來(lái)鑒定蛋白的類型，這些參數(shù)的值越大，蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性越高。

如表1所示，鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白肽段覆蓋率為59.2%、金鯧魚(yú)肽段覆蓋率為54.1%、鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白為42.7%，鱖魚(yú)有10 個(gè)特征肽段，金鯧魚(yú)有24 個(gè)特征肽段，鱘魚(yú)有12 個(gè)特征肽段。鑒定結(jié)果顯示，鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白的蛋白分子質(zhì)量和主鏈氨基酸數(shù)量均有差異。鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白全序列氨基酸數(shù)量為377，分子質(zhì)量為41 944 Da，金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白全序列氨基酸數(shù)量為375，分子質(zhì)量為41 766 Da，蛋白分子質(zhì)量和全序列氨基酸數(shù)量均大于鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白（部分序列氨基酸數(shù)量為248，分子質(zhì)量為27 921 Da）。鱘魚(yú)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有完整的肌動(dòng)蛋白氨基酸全序列，只有2 個(gè)部分序列，因此鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白酶解后質(zhì)譜鑒定匹配到的肽段數(shù)、蛋白分子質(zhì)量和主鏈氨基酸數(shù)量均小于鱖魚(yú)和金鯧魚(yú)肌動(dòng)蛋白。

2.3 鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白肽指紋圖譜的建立

鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解得到的片段經(jīng)Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜分析，可鑒定出全部的肽段。得到的肽段經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析可鑒定出肽段的來(lái)源，如TTGIVLDAGDGVTHNVPVYEGYALPHAIMR、EDEIAALVVDNGSGMCK、LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK分別屬于鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白、金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白和鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白的酶解肽段。鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白、金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白和鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到的全部肽段序列信息分別見(jiàn)表2～4，差異肽段見(jiàn)表5，同時(shí)，通過(guò)搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得肌動(dòng)蛋白的氨基酸全序列（表6），結(jié)果中沒(méi)有搜索到鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白的完整氨基酸序列，僅有2 個(gè)部分序列。

表2 鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白肽段氨基酸序列信息Table 2 Information about peptide sequence of α-actin in S.chuatsi skeletal muscle

表3 金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白肽段氨基酸序列信息Table 3 Information about peptide sequence of T.ovatus β-actin

續(xù)表3

表4 鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白肽段氨基酸序列信息Table 4 Information about peptide sequence of A.sinensis β-actin

表6 鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白氨基酸序列對(duì)比Table 6 Comparison of amino acid sequences of S.chuatsi, T.ovatus and A.sinensis actin

由表2～4可知，不同來(lái)源的肌動(dòng)蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后質(zhì)譜檢測(cè)得到的肽段數(shù)量有差異。肽段數(shù)量最多的為鱖魚(yú)肌動(dòng)蛋白，酶解后可檢測(cè)到29 個(gè)肽段，金鯧魚(yú)共檢測(cè)到24 個(gè)肽段，全為特征肽段，而鱘魚(yú)最多檢出13 個(gè)肽段。3 種魚(yú)類肌動(dòng)蛋白酶解得到的所有肽段中有多個(gè)相同的肽段。

由表5可知，鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白、金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白和鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白的指紋譜中均有不同數(shù)量的差異肽段。與另外2 種魚(yú)類肌動(dòng)蛋白的指紋譜相比，鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白有10 個(gè)差異肽段，金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白有5 個(gè)差異肽段，鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白酶解后鑒定到的肽段數(shù)量最少，僅有3 個(gè)差異肽段，因鱘魚(yú)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)不完善，搜庫(kù)中無(wú)法匹配到鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白氨基酸全序列，這3 個(gè)肽段在蛋白氨基酸全序列位置無(wú)法確認(rèn)，隨著鱘魚(yú)蛋白基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)深入研究，有望得到進(jìn)一步相關(guān)論證。

表5 鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)肌動(dòng)蛋白肽指紋譜的差異性Table 5 Difference in fingerprints of actin peptides in S.chuatsi,T.ovatus and A.sinensis

由表6可知，鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白和金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白由于蛋白類型不同，它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)在氨基酸數(shù)量和排列方面存在明顯差異：鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白序列有377 個(gè)氨基酸，金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白序列有375 個(gè)氨基酸；2 個(gè)氨基酸序列從相似序列開(kāi)始發(fā)生了21 處氨基酸變異（鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白從第12個(gè)氨基酸開(kāi)始，金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白從第10個(gè)氨基酸開(kāi)始，2 個(gè)序列為相似的氨基酸序列。氨基酸變異位置用括號(hào)標(biāo)出）。鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白和部分鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白氨基酸序列從相似序列開(kāi)始發(fā)生了17 處氨基酸的變異（從鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白第74位氨基酸開(kāi)始，2 個(gè)序列為相似的氨基酸序列。氨基酸變異位置用下劃線標(biāo)出）；部分鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白的氨基酸序列與金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白的序列同源性較高，僅有3 個(gè)氨基酸存在變異，分別在第160、228、279位氨基酸處。

3 結(jié) 論

采用Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜技術(shù)分析3 種魚(yú)類肌動(dòng)蛋白肽質(zhì)指紋譜，肽段序列和蛋白氨基酸全序列比對(duì)結(jié)果表明，鱖魚(yú)肌動(dòng)蛋白全序列氨基酸數(shù)量和蛋白分子質(zhì)量均高于金鯧魚(yú)和鱘魚(yú)。鱖魚(yú)肌動(dòng)蛋白全序列氨基酸數(shù)量為377，分子質(zhì)量為41 944 Da；金鯧魚(yú)全序列氨基酸數(shù)量為375，分子質(zhì)量為41 766 Da；鱘魚(yú)部分序列氨基酸數(shù)量為248，分子質(zhì)量為27 921 Da。鱖魚(yú)肌動(dòng)蛋白的酶解肽段質(zhì)譜檢測(cè)到29 個(gè)肽段，鑒定為骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白；金鯧魚(yú)檢測(cè)到24 個(gè)肽段，鱘魚(yú)則檢出13 個(gè)肽段，均鑒定為β-肌動(dòng)蛋白；與另外2 種魚(yú)類肌動(dòng)蛋白的肽質(zhì)指紋譜相比，鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白有10 個(gè)差異肽段，金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白有5 個(gè)差異肽段，鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白有3 個(gè)差異肽段，從氨基酸全序列的排列方式來(lái)看，鱖魚(yú)骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白與金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白從相似序列開(kāi)始共有21 處氨基酸變異，與鱘魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白從相似序列開(kāi)始共有17 處氨基酸變異，鱘魚(yú)部分β-肌動(dòng)蛋白氨基酸序列與金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白的序列同源性較高，僅在金鯧魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白第160、228、279位氨基酸處存在變異。開(kāi)展魚(yú)肌動(dòng)蛋白肽質(zhì)指紋譜研究將為名貴魚(yú)類質(zhì)量品質(zhì)屬性的鑒定、魚(yú)類肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的研制及魚(yú)蛋白高通量芯片檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供新思路與參考依據(jù)，具有重要現(xiàn)實(shí)意義與廣泛的應(yīng)用前景。