黑果腺肋花楸果中總花色苷含量測定方法的比較

趙 婧，李涵涵，千 文，樸昌善，楊長青,*

（1.中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院，江蘇 南京 211198；2.南京珼瑞斯生物醫藥科技有限公司，江蘇 南京 211100；3.延邊日鑫生物科技有限公司，吉林 延吉 133000）

黑果腺肋花楸（Aornia melanocarpa）為薔薇科腺肋花楸屬植物。果實富含多酚、有機酸、蛋白質等多種營養物質[1]，并且多酚類物質的含量在已知漿果中居于榜首[2]。花青素作為黑果腺肋花楸果的主要多酚類物質，在自然狀態下通常以不穩定的花青素結構單元和糖類結合形成穩定的糖配體，即花色苷形式存在[3]。花色苷具有抗炎、抗氧化、改善視力、消除自由基、預防心腦血管疾病等多種生物活性[4-5]，因此黑果腺肋花楸果具有藥用開發潛力。

目前，花色苷含量的測定方法主要有pH示差法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和高效液相色譜-質譜聯用法[1]。其中，pH示差法主要采用花色苷在不同pH值的分子結構變化，進而改變顏色以定量測定[6]，其測定結果通常受外界條件及輔色素轉化等因素影響[7]，若測定以黑果腺肋花楸果中含量最低[1,8]的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標準[9-10]進行計算可能引起誤差[7,11]。自然界中花色苷形式眾多，標準品昂貴且不易獲取，因此HPLC法大多采用1～2 種對照品為標準，通過相對分子質量校正以定量計算總花色苷含量[12-15]，或采用鹽酸水解糖苷的方法，通過測定花青素單體的含量間接表示花色苷含量[16]，但花色苷分子質量的差異、水解后苷元穩定性降低等問題均可能會對結果造成偏差[17-18]。高效液相色譜-質譜聯用法分辨率高、靈敏度高，可用于含量低、結構復雜的花色苷含量測定，也可鑒別未知結構[1,19-20]，但此方法價格昂貴，不利于測定方法的普及。目前，國內鮮見采用混合標樣HPLC法和以矢車菊素-3-O-半乳糖苷摩爾吸光系數為標準的pH示差法測定黑果腺肋花楸果中總花色苷含量的報道。因此，本研究運用優化前后的pH示差法和HPLC法測定延邊地區4 個種植基地黑果腺肋花楸果實中總花色苷，通過比較不同方法測定結果的準確性，進而優選黑果腺肋花楸果實中總花色苷含量的最佳測定方法，以期為黑果腺肋花楸果花色苷質量標準的建立及開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸果實1～4號均由延邊日鑫生物科技有限公司提供，經采摘挑選后冷凍干燥，用粉碎機粉碎，過40 目篩，于4 ℃避光密封保存。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（批號DST180622-019、含量98%） 成都德思特生物技術有限公司；矢車菊素-3-O-木糖苷（批號AR9781W1，純度98%） 寶雞辰光生物科技有限公司；矢車菊素-3-O-半乳糖苷（批號20190612，純度98%）、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷（批號20190612，純度98%） 南京珼瑞斯生物醫藥科技有限公司；乙醇（分析純） 美國Merck Drugs &Biotechnology公司；甲醇（色譜純） 美國TEDIA公司；磷酸溶液（分析純） 上海凌峰化學試劑有限公司；純化水 杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-2010AHT高效液相系統（配備四元高壓泵、紫外檢測器） 日本Shimadzu公司；Galaksil?EF C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 無錫加萊克色譜科技有限公司；冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；KH-250DB型數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花色苷的提取

取黑果腺肋花楸果粉（冷凍干燥品）0.2 g于具塞試管中，加入5 mL體積分數60%乙醇溶液（含0.096 mol/L鹽酸），40 ℃超聲30 min，于室溫、2 500 r/min離心5 min，果渣再重復提取2 次，收集所有離心后上清液用60%乙醇溶液（含0.096 mol/L鹽酸）定容至25 mL，室溫保存。

1.3.2 標準溶液的配制

取矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷適量，分別用鹽酸-甲醇（2∶98，V/V）配制，得1 mg/mL對照品儲備液；取各對照品儲備液適量，用鹽酸-甲醇（2∶98，V/V）制得含有矢車菊素-3-O-半乳糖苷225 μg/mL、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷7.2 μg/mL、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷72 μg/mL、矢車菊素-3-O-木糖苷30 μg/mL的混合對照品溶液，均置于4 ℃中保存備用。

1.3.3 HPLC條件

色譜柱：Galaksil?EF-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）、體積分數8.5%甲酸溶液（B），按以下條件勻速梯度洗脫：0～5 min，90%～78% A、10%～22% B；5～7.5 min，78% A、22% B；7.5～11.5 min，78%～92% A、22%～8% B；11.5～14.5 min，92%～60% A、8%～40% B；14.5～18.5 min，60% A、40% B；18.5～20 min，60%～90% A、40%～10% B；20～23 min，90% A、10% B。流速1.0 mL/min；檢測波長525 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.4 花色苷含量的計算

1.3.4.1 單標樣HPLC法

根據SW/T 2—2013《越橘提取物國際商務標準》[21]，按式（1）計算花色苷含量：

式中：i為黑果腺肋花楸果中相應花色苷組分（對照品色譜峰1～4）；Ci為經標準曲線計算所得花色苷組分質量濃度/（μg/mL）；V為花色苷提取液定容體積/mL；m為黑果腺肋花楸果實稱樣質量/g；F為稀釋倍數（5）；Mi為黑果腺肋花楸果中相應花色苷組分的相對分子質量；Mstda為對照品花色苷相對分子質量。

1.3.4.2 pH示差法

參照孫婧超[22]和楊萍[23]等的方法并優化。取2 份0.5 mL花色苷提取液分別加入KCl-HCl（25∶67，V/V）緩沖液（pH 1.0）、NaAc-HCl（1∶1，V/V）的緩沖液（pH 4.5）4.5 mL，避光、40 ℃恒溫水浴30 min，以提取溶劑為空白對照，在515、700 nm波長處測定溶液吸光度，按式（4）、（5）分別以矢車菊素-3-O-半乳糖苷摩爾吸光系數、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾吸光系數計算黑果腺肋花楸果中總花色苷的含量。

式中：ε為對照品摩爾吸光系數/（L/（mol·cm）），其中ε矢車菊素-3-O-半乳糖苷、ε矢車菊素-3-O-葡萄糖苷分別為23 505、26 900 L/（mol·cm）[9]；M為對照品相對分子質量；V為最后定容的體積/mL；F為稀釋倍數（10）；m為黑果腺肋花楸果實稱樣量/g；L為比色皿的寬度（1 cm）；A515nm、A700nm分別為提取液在515、700 nm波長下的吸光度；ΔA1.0、ΔA4.5為pH 1.0、4.5條件下提取液的不同波長吸光度差值；ΔA為ΔA1.0、ΔA4.5差值。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 HPLC法

2.1.1 線性范圍

2.1.1.1 單標樣HPLC法的標準曲線

取1.3.2節質量濃度均1 mg/mL矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品儲備液，分別逐級稀釋得質量濃度0.5、1.0、5.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的系列對照品溶液，再經1.463 mol/L磷酸溶液稀釋5 倍后制得0.1、0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL對照品溶液，進樣檢測[17]，HPLC分析結果如圖1所示。

圖1 花色苷HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of anthocyanin standards

2.1.1.2 混合標樣HPLC法的標準曲線

取1.3.2節的混合對照品儲備液，逐級稀釋分別制得矢車菊素-3-O-半乳糖苷質量濃度24.0、48.0、96.0、120.0、150.0、180.0、225.0 μg/mL；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷質量濃度0.8、1.5、3.1、3.8、4.8、5.8、7.2 μg/mL；矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷質量濃度7.9、15.4、30.7、38.4、48.0、57.6、72.0 μg/mL；矢車菊素-3-O-木糖苷質量濃度3.2、6.4、12.8、16.0、20.0、24.0、30.0 μg/mL的系列對照品混合溶液，再經1.463 mol/L磷酸溶液稀釋5 倍后分別制得矢車菊素-3-O-半乳糖苷質量濃度4.8、9.6、19.2、24、30、36.4、45 μg/mL；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷質量濃度0.2、0.3、0.6、0.8、1.0、1.1、1.4 μg/mL；矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷質量濃度1.5、3.1、6.1、7.7、9.6、11.5、14.4 μg/mL；矢車菊素-3-O-木糖苷質量濃度0.6、1.3、2.6、3.2、4.0、4.8、6.0 μg/mL的對照品混合溶液，進樣檢測[17]，HPLC結果如圖1C所示。花色苷溶液標準曲線結果見表1。

表1 花色苷的線性回歸方程Table 1 inear regression equations for anthocyanins

2.1.2 精密度、穩定性、重復性及加樣回收率

取混合對照品溶液連續進樣6 次，記錄各對照品色譜峰面積，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。樣品中矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷峰面積的RSD（n=6）分別為0.06%、0.66%、0.18%、0.32%。表明方法的精密度良好。

取黑果腺肋花楸果粉4號樣品，按1.3.1節的方法制備供試液1 份，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣分析，記錄峰面積，計算RSD。樣品中矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷峰面積的RSD（n=8）分別為0.44%、0.69%、1.31%、2.69%。表明花色苷提取液在24 h內穩定。

取黑果腺肋花楸果粉4號樣品，按1.3.1節的方法制備供試液6 份，進樣后按照標準曲線法計算各成分含量。樣品中矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷含量分別為（15.985±0.113）、（0.219±0.003）、（5.491±0.034）、（1.467±0.013）mg/g，RSD（n=6）分別為0.71%、1.28%、0.62%、0.91%，表明方法的重復性良好。

取黑果腺肋花楸果粉4號樣品0.1 g，共6 份，分別精密加入對照品溶液，按1.3.1節的方法制備供試溶液，進樣分析，計算加樣回收率。樣品中矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷回收率分別為95.03%、99.17%、95.93%、99.10%，RSD（n=6）分別為3.14%、2.54%、3.54%、3.83%，表明方法的準確度良好。

2.1.3 樣品測定

取黑果腺肋花楸果粉樣品1～4號，一式三份，按1.3.1節的方法制備花色苷提取液，再經1.463 mol/L磷酸溶液配制，將其稀釋5 倍后進樣檢測[17]，帶入單標和混標的標準曲線，分別計算各組分花色苷單體含量及花色苷的總含量。花色苷總量數據之間采用單因素方差分析顯著差異。結果如表2所示。

表2 HPLC法測定黑果腺肋花楸果中花色苷的含量（n=3）Table 2 Anthocyanin contents in black chokeberry determined by HPLC with different reference standards (n = 3)

以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標樣計算的花色苷總量均與其他2 種方法的結果比較具有顯著差異（P＜0.05），其原因可能與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在黑果腺肋花楸果中花色苷含量占比最低有關。黑果腺肋花楸果中矢車菊素-3-O-半乳糖苷約占總花色苷的65.6%，而矢車菊素-3-O-葡萄糖苷僅占2.5%[24]，因此用非主要花色苷單體作為標樣計算黑果腺肋花楸果中花色苷含量明顯偏離真實結果。以矢車菊素-3-O-半乳糖苷為標樣計算的花色苷總量與混合標樣結果無顯著差異（P＞0.05），因此采用混合標樣HPLC法計算結果最準確，但以矢車菊素-3-O-半乳糖苷為單標樣的HPLC法結果可靠，且方法經濟、簡便，同樣適用于黑果腺肋花楸果中花色苷的含量測定。

2.2 pH示差法

2.2.1 摩爾吸光系數

配制質量濃度分別為0.020、0.025、0.050、0.075、0.100、0.150、0.20 mg/mL的矢車菊素-3-O-半乳糖苷系列對照品溶液，按1.3.4.2節的方法得到對照品溶液吸光度，以對照品質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線，結果表明：矢車菊素-3-O-半乳糖苷在0.02～0.20 mg/mL范圍內線性關系良好，得線性回歸方程Y=48.481X+0.011 1（r=0.999 9），經計算矢車菊素-3-O-半乳糖苷在515 nm波長處、60%乙醇（含0.096 mol/L鹽酸）溶液中摩爾吸光系數為23 505 L/（mol·cm）。采用位路路等[9]矢車菊素-3-O-葡萄糖苷吸光系數26 900 L/（mol·cm）。

2.2.2 樣品測定

取黑果腺肋花楸果樣品1～4號，一式三份，按1.3.1、1.3.4.2節的方法分別制備供試溶液、計算花色苷總含量。各組數據之間采用t檢驗比較顯著性差異，結果見圖2。以矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷共2 種花色苷各自摩爾吸光系數計算的結果之間存在顯著差異（P＜0.05）。樣品1～4號中花色苷含量以矢車菊素-3-O-半乳糖苷摩爾吸光系數計算結果分別為（26.67±0.50）、（25.61±0.38）、（25.61±0.29）、（22.68±0.38）mg/g；以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾吸光系數計算結果分別為（23.30±0.44）、（22.38±0.33）、（22.38±0.25）、（19.82±0.33）mg/g。不同溶劑、波長檢測物質的摩爾吸光系數存在差異[22]，因此計算過程需要考慮實際的檢測波長及溶劑情況。黑果腺肋花楸果中花色苷主要以矢車菊素-3-O-半乳糖苷為主，因此以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾吸光系數計算的結果必然會有誤差[25]。結合以矢車菊素-3-O-半乳糖苷為標準的單標樣HPLC法測定結果可知，使用pH示差法時以矢車菊素-3-O-半乳糖苷摩爾吸光系數計算的結果更加準確。

圖2 基于pH示差法以矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾吸光系數計算黑果腺肋花楸果中花色苷的含量（n=3）Fig.2 Anthocyanin contents in black chokeberry determined by pH differential method based on the molar extinction coefficients of cyanidin 3-O-galactopyranoside and cyanidin 3-O-glucoside (n = 3)

2.3 混合標樣HPLC法和pH示差法的比較

黑果腺肋花楸果樣品經過2.1、2.2節方法計算后，采用t檢驗比較混合標樣HPLC法測定結果和pH示差法測定結果間顯著差異的結果如圖3所示。1、3號樣品pH示差法測定結果與HPLC法測定結果之間存在顯著差異（P＜0.05），2、4號樣品的2 種方法結果間無顯著差異（P＞0.05）。周丹蓉等[26]報道果實中花色苷含量越高，pH示差法與HPLC法所測花色苷的結果差異越大，而本實驗1號和3號花色苷總含量經HPLC法測定均高于2號和4號，因此與周丹蓉等[26]的結論相符。另外4 個樣品HPLC法測定的花色苷總量均高于pH示差法，這也劉玉芹[27]和Wu Xianli[28]等報道的結論一致。導致以上結果的可能原因為花色苷通常與輔色素結合，以共呈色的形式存在[29]，因此花色苷含量越高，這種作用越強。這種現象往往會導致偏離朗格比爾定律[30]的現象出現，從而影響pH示差法對花色苷的含量測定。其次，pH示差法僅針對游離狀態的花色苷分子，而聚合形式的花色苷在pH值分別為1.0、4.5時均有吸收[31]，因此在pH值為1.0時，輔色素不完全轉化導致游離態花色苷分子較少[32]，可能為pH示差法結果偏低的另一個原因。此外，pH示差法還比較容易受儀器、溫度、溶液pH值及操作的影響[17]。因此混合標樣HPLC法測定結果比pH示差法更加準確。

圖3 pH示差法和HPLC法對花色苷總含量測定的比較（n=3）Fig.3 Comparison of total anthocyanin contents in black chokeberry determined by optimized pH differential method and HPLC (n = 3)

3 結 論

本實驗對黑果腺肋花楸果中總花色苷含量測定方法進行優化和比較，結果表明：混合標樣HPLC法為黑果腺肋花楸果果實總花色苷含量測定的最準確的方法，但成本較高；以矢車菊素-3-O-半乳糖苷作單標樣的HPLC法操作簡單、結果準確、經濟成本適宜，同樣適用于黑果腺肋花楸果實總花色苷的測定。本研究為黑果腺肋花楸果實及其相關產品質量標準的建立及開發提供理論依據。