釀造醬油氨基酸態氮含量和級別的快速檢測

高向陽，張 芳

（1.鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064；2.鄭州市食品安全快速檢測重點實驗室，河南 鄭州 450064）

釀造醬油是以大豆、小麥或麩皮為原料，經一定工藝和微生物發酵制成的具有特殊色、香、味的紅褐色或棕褐色液體調味品，醬香較濃、味鮮咸適口[1-3]、營養豐富[4]，且有抗氧化[5-6]、降血壓的作用[7-9]，是大眾日用必備功能性調料。GB 18186—2000《釀造醬油》規定氨基酸態氮（以氮計）含量大于等于0.80 g/100 mL為特級；大于等于0.70 g/100 mL為一級；大于等于0.60 g/100 mL為二級（低鹽固態發酵醬油）、大于等于0.55 g/100 mL為二級（高鹽稀態發酵醬油）；大于等于0.40 g/100 mL為三級[10]。

GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮含量的測定》的第一法為酸度計法[11]，其選用NaOH標準溶液滴定，因pH玻璃電極可產生顯著的“鈉差”[12-14]，使結果明顯偏低[15-17]；而且該法未考慮甲醛試劑可能含有的甲酸[18]對測定結果的影響[19-21]。該法加入甲醛轉化氨基酸態氮前，試液用NaOH標準溶液滴定至pH 8.2，加入甲醛后滴定至pH 9.2為終點，此滴定過程違背定量分析中的“等物質的量轉化和反應原則”[22]。酸度計不但受溫度的影響，且需要用電和標準溶液及時校正[23-25]。滴定劑用量需代入公式計算結果，判斷不直觀、工作效率較低。

本實驗擬建立衡量釀造醬油氨基酸態氮含量符合一定級別的快速檢測方法，無需用電源和酸度計等儀器，以消除電極的“鈉差”，并避免響應時間“滯后”導致標準溶液滴過終點的不足。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

加加草菇生抽、加加金標生抽 鄭州加加味業有限公司；李錦記精選生抽、李錦記味極鮮醬油、李錦記錦珍老抽 李錦記（新會）食品有限公司；魯花自然鮮醬油 山東魯花生物科技有限公司；廚邦海鮮醬油廣東美味鮮調料食品有限公司；海天老抽 佛山市海天調味食品股份有限公司。

活性炭200 目 上海市易恩化學技術有限公司；中性甲醛（質量分數為37%～40%） 西隴科學有限公司；氫氧化鉀、NaOH（均為分析純） 國藥集團化學試劑上海有限公司；pH 6.8的蒸餾水。

1.2 儀器與設備

電子萬用爐 北京市永光明醫療儀器有限公司；UV-2800AH型紫外-可見分光光度計、UV-4802H型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；PXSJ-216離子計 上海儀點科學儀器股份有限公司；機械型超聲波清洗儀 上海合金超聲設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別稱取NaOH 2.857 0、3.929 0、4.286 0、5.000 0、5.714 0 g放置于小燒杯中，加50 mL蒸餾水溶解后，分別移入5 個250 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻以配制0.285 7、0.392 9、0.428 6、0.500 0、0.571 4 mol/L NaOH標準溶液備用。

1.3.2 紫薯色素的制備[26-27]

取鮮紫薯5 g切成片狀，于研缽中研磨成糊狀，按料液比1∶5（g/mL）加入蒸餾水（pH 6.8），移入100 mL比色管中，置于功率500 W的55 ℃超聲波清洗器中，提取15～20 min后過濾得到紫薯色素，置于滴瓶中備用。

1.3.3 中性甲醛的配制

向36%～38%甲醛溶液中滴加4～6 滴紫薯色素，混勻后逐滴滴加NaOH溶液，當溶液顏色由紅橙色變為橙灰色且30 s內不褪色時，停止滴定，密閉保存，備用。

1.3.4 pH值與紫薯色素顯色關系的測定

取12 個100 mL小燒杯，各加約40 mL蒸餾水，酸度計上逐滴滴加0.10 mol/L HCl或0.10 mol/L NaOH溶液，調節至pH值分別為2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00、13.00，然后各滴加4 滴紫薯色素，搖勻后，分別移取5 mL溶液于25.00 mL比色管中，觀察紫薯色素在不同pH值溶液中的顏色變化，并記錄pH值及其對應溶液顏色。

1.3.5 樣品的脫色

取1.00 mL李錦記味極鮮醬油于試管中，加9.00 mL水和0.12 g活性炭振蕩，靜置2 min，混合液過濾，用加入0.40 g活性炭處理的樣液為空白，于336.0 nm波長處測定吸光度。再分別用0.16、0.20、0.24、0.28、0.30、0.32 g活性炭處理后的醬油溶液用上述同樣的方法測定其吸光度并按式（1）計算脫色率：

式中：A0為稀釋至10 倍醬油樣品未脫色時測定的吸光度；A為稀釋至10 倍醬油樣品加入不同量活性炭脫色后測定過濾液的吸光度。

1.3.6 醬油樣品的等級及其參數測定

用移液槍移取1.00 mL醬油原樣于25 mL比色管中，加入9.00 mL蒸餾水稀釋，加0.30 g活性炭，用玻璃棒輕輕攪動脫色，2 min后過濾，用移液槍取1.00 mL過濾澄清液于10 mL比色管中，滴加2～3 滴天然紫薯色素，此時溶液為紅色或紅橙色。用滴管逐滴加0.050 mol/L NaOH標準溶液至顏色為橙灰色時加入2.00 mL中性甲醛，把所取1.00 mL醬油過濾液中的氨基酸態氮完全轉化為酸性羧基（—COOH），此時溶液為紅色或紅橙色，然后加入1.00 mL符合各級別等物質量的NaOH標準溶液，輕搖2～3 s后觀察溶液顏色，根據表1所示顏色及對應參數細則判斷所屬釀造醬油等級。若溶液呈紅色、紅橙色、橙灰色，則為合格產品；若溶液呈藍灰、綠土或黃棕色，則為不合格產品。各級別產品溶液中剩余的酸性物質的量大小順序為紅色＞紅橙色＞橙灰色。溶液中剩余NaOH的量大小順序為黃棕色＞綠土色＞藍灰色。被檢測溶液酸堿“等量點”顯示指示劑紅橙色、藍灰色的混合色，即橙灰色。

表1 釀造醬油中的氨基酸態氮各級別參數Table 1 Minimum amino acid nitrogen concentration for each grade of brewed soy sauce

2 結果與分析

2.1 溶液pH值與紫薯色素呈現顏色

由圖1可知，紫薯色素在pH 2.00～3.00的溶液中為紅色，pH 4.00～7.00的溶液中為紅橙色，pH 8.00時為橙灰色；pH 9.00時為藍灰色，在pH 10.00～11.00的溶液中為綠土色，pH 12.00～13.00時為黃棕色，是溶液酸度指示的理想食用呈色劑。

圖1 紫薯色素在不同pH值下的呈色圖Fig.1 Color of purple sweet potato colorant under different pH conditions

2.2 NaOH標準溶液目標濃度的設定

氨基酸加入中性甲醛后，堿性氨基（—NH2）與甲醛結合，堿性消失，而呈現酸性的—COOH與NaOH標準溶液發生等物質的量反應。各級別產品加入中性甲醛轉化氨基酸態氮時，要求氮的最低濃度即要求的氨基酸最低濃度，也是轉化后要求羧基的最低目標濃度，因此，各級合格產品中—COOH的最低目標濃度應等于其氮的最低濃度除以氮的摩爾質量，各級別合格產品對應的最低質量濃度為：三級、二級（對高鹽稀態發酵醬油）、二級（對低鹽固態發酵醬油）、一級和特級。

配制相應級別同濃度的NaOH標準溶液，當其與樣品中的—COOH發生“等物質的量反應”后，若羧基剩余，則相應級別產品中氨基酸的含量高，判定為合格的產品；若羧基不足，強堿（—OH）剩余，則釀造醬油中氨基酸的含量低于相應級別的要求，判定為不合格產品。若所取樣品中—COOH的物質的量與加入NaOH的物質的量相等，反應正好達到所要求級別最低指標的理論終點，溶液呈現的是指示劑紅橙色和藍灰色的混合色，即橙灰色，此情況較為罕見。

2.3 NaOH標準溶液的標定和調節

分別準確稱取105 ℃烘至恒量的鄰苯二甲酸氫鉀基準試劑0.6～1.2、0.8～1.6、0.8～1.8、1.0～2.0、1.2～2.5 g（均準確至0.000 1 g）于潔凈錐形瓶中，加蒸餾水約40 mL溶解，各加入紫薯色素4 滴，分別用0.285 7、0.392 9、0.428 6、0.500 0、0.571 4 mol/L NaOH標準溶液標定，當溶液由紅橙色變為橙灰色且30 s內不褪色時為滴定終點，記錄消耗NaOH溶液的體積V1（mL），同時取40 mL蒸餾水進行空白實驗和顏色比對，按式（2）計算濃度：

式中：C（NaOH）為NaOH標準溶液的濃度/（mol/L）；m為稱取鄰苯二甲酸氫鉀的質量/g；204.22為鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質量（g/mol）；V0為空白液所消耗NaOH溶液的體積/mL；V1為標定質量為m的鄰苯二甲酸氫鉀所消耗NaOH溶液的體積/mL。

各做4 次平行標定，檢驗無可疑值后取平均值，若濃度低于或高于目標濃度，計算既有濃度后，添加固體NaOH或計算并添加蒸餾水，直至重新標定后達到目標濃度。

2.4 活性炭用量對樣品脫色的影響

如圖2所示，加入活性炭后靜置2 min，活性炭最佳用量為0.30 g，脫色率為92.56%，脫色效果理想。

圖2 活性炭用量對醬油脫色的影響Fig.2 Effect of activated carbon dosage on the decolorization of soy sauce

2.5 對照測定結果

按GB 5009.235—2016的第一法酸度計法對樣品進行測定，將試樣溶液的顏色、氨基酸態氮含量與商品標注值進行比較，結果如表2所示。GB 5009.235—2016法樣品測定結果均高于商品標注值。

表2 釀造醬油原樣品對照測定結果Table 2 Results of determination of amino acid nitrogen in original samples of brewed soy sauce

2.00 mL中性甲醛可將所取100 μL原醬油樣品中的氨基酸態氮完全轉化為等物質量的酸性物質（—COOH）[10-11]。用移液槍加目標濃度的NaOH溶液100 μL，輕搖2～3 s后觀察溶液顏色，此時溶液仍為紅色、紅橙色或橙灰色且30 s內不褪色，則產品為合格的發酵醬油，若為灰藍色、綠土色或黃棕色且30 s內不褪色，則產品為不合格。

2.6 驗證實驗結果

將醬油原樣按照一定的比例用蒸餾水稀釋后作為樣品，根據GB 5009.235—2016第一法平行測定3 次，檢驗無可疑值后取平均值。釀造醬油原樣稀釋1、5 倍后的檢測結果和紫薯色素的顏色、相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別如表3、4所示。

表3 釀造醬油原樣稀釋1 倍后的檢測結果及驗證Table 3 Results of determination and verification of amino acid nitrogen in one-fold diluted brewed soy sauce

表4 釀造醬油原樣稀釋5 倍后的檢測結果及驗證Table 4 Results of determination and verification of five-fold diluted brewed soy sauce

由表3、4可知，醬油原樣品稀釋1、5 倍后作為樣品，按照GB 5009.235—2016第一法進行3 次平行測定的RSD均小于7.5%。

根據各級別釀造醬油的氨基酸態氮的合格指標，按照“等物質的量反應”原則，取100 μL原釀造醬油樣品，即可加入100 μL目標濃度的NaOH標準溶液進行快速鑒別。按所述步驟方法鑒別時，樣品溶液中剩余的酸性物質（—COOH）的量從多到少的對應順序為紅色＞紅橙色＞橙灰色；溶液中剩余的一元強堿（—OH）量從大到小對應順序為黃棕色＞綠土色＞灰藍色。

3 結 論

根據釀造醬油不同級別氨基酸態氮參數合格的最低要求，科學設計NaOH溶液的濃度。依據等物質的量反應原則，加入同量的一元強堿溶液，如果所取醬油樣品中氨基酸態氮的量大于一元強堿溶液的量，用中性甲醛轉化氨基酸態氮生成的酸性物質（—COOH）的量也大于一元強堿溶液的量。反應完成后，酸性物質剩余，該產品為合格產品，剩余的酸越多，產品質量相對越好；若所取釀造醬油等物質的量轉化出酸性物質的量等于加入的一元強堿溶液的量，反應恰好到達相應級別醬油最低要求的理論終點，釀造醬油為符合最低指標要求的合格產品；若所取醬油轉化出的酸性—COOH的量小于加入的一元強堿溶液的量，強堿剩余，則該釀造醬油中的氨基酸態氮低于相應級別的最低要求，為不符合相應級別的產品，可用隨pH值增加而呈色明顯不同紫薯色素快速鑒別。紫薯色素在pH 2.00～3.00溶液中為紅色，pH 4.00～7.00的溶液中為紅橙色，pH 8.00時為橙灰色；紫薯色素呈現紅色、紅橙色和橙灰色時，釀造醬油為合格產品；紫薯色素為藍灰色、綠土色、黃棕色時釀造醬油為不合格產品。

該法所需樣品、試劑、標準溶液量少，無需用電和儀器，因此成本低廉，具有操作簡便、快速、判斷直觀的突出優點，為釀造醬油產品質量的快速鑒別提供新的檢測方法，有較強的推廣應用價值。