HS-SPME-GC-MS結合電子鼻對10 個品系紅松籽油揮發性物質分析比較

王 賀，趙玉紅,2,*，楊 凱

（1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省林業科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150081）

紅松（Pinus koraiensis）是松科常綠喬木，主要分布在中國東北、俄羅斯東南部、朝鮮半島和日本[1]，紅松籽是紅松的果實，也是我國農業重要的產品之一[2]，松籽油是以紅松籽為原料得到的油脂，松籽油作為天然無環境污染的綠色木本植物油脂，具有預防糖尿病[3]、心腦血管疾病[4]、降低膽固醇[5]、防癌等功能[6]，是世界公認的優質植物油，松籽油不飽和脂肪酸含量高達80%以上，并含有豐富的功能活性成分，如角鯊烯、芝麻素、谷甾醇和蝦青素等甾醇類物質[7-8]。除了營養成分外，其細膩獨特的風味深受消費者喜愛，大多作為調味品使用，松籽油特有的風味與揮發性化合物密切相關[9]。

揮發性成分是確定油脂品質的重要屬性，對消費者的接受程度起關鍵作用[10]。揮發性成分主要包括醇類、醛類、酸類、呋喃類、吡嗪類、噻唑類、吡咯類等[11-12]，受品種、生長階段、氣候、貯存和加工方法等因素的影響[13-14]，這些因素決定揮發性成分的定量和定性組成，而品種多樣性是影響揮發性成分的重要因素[15]。目前不同品系（種）松籽油的研究主要集中在理化性質、營養成分、功能分析等方面[16-18]，有關不同品系紅松籽油揮發性成分差異的研究鮮見報道。

頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用技術廣泛用于揮發性成分的定性和定量分析，該技術具有操作簡單、節約時間、準確性和安全性高等優點，但該方法價格昂貴且不能用于檢測揮發性氣味的成分[19]，而電子鼻（electronic nose，E-nose）技術可以模仿人類的嗅覺功能以識別氣味，可以準確區分不同的樣本氣味[20]，能夠快速、準確地提供氣味檢測結果，但運用E-nose技術不能對揮發性成分進行定性、定量分析[21]。因此，本實驗結合2 種對風味進行分析，可以起到良好的驗證和相互補充的作用，能更好地區分油脂的風味化合物的特征差異[22]。HS-SPME-GC-MS與E-nose相結合的方法已應用于不同品種橄欖油的分類[23]，識別不同氧化期間風味化合物的薏仁油[24]，但這些研究并未分析這2 種技術之間的相關性，且這2 種技術對不同品系松籽油揮發性物質相關性分析的研究也較少。

本實驗采用HS-SPME-GC-MS結E-nose技術，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）等方法對10 個東北優良品系紅松籽油的揮發性風味成分進行分析和評價，旨在為松籽油生產加工過程的品質評價與控制提供參考，為建立松籽油特征信息數據庫和松籽油風味遺傳改良的育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

25 個品系（品種）中選取10 個優良品系的紅松松籽由黑龍江省林業局下屬林業科學研究院提供，編號為S-31、S-34、S-49、S-72、S-123、S-124、S-125、S-130、S-154、S-185，以上樣品依次簡稱為樣品1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；于-20 ℃貯藏。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A GC-MS譜聯用儀 美國安捷倫公司；固相微萃取器手柄、30/50 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭美國Supelco公司；sniffer 9000嗅聞裝置 瑞士Brechbuhler公司；PEN3 E-nose傳感器 上海瑞玢國際貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 松籽油樣品的制備

將松籽去殼后得到的松仁磨成粉末，根據Kemerli-Kalbaran等[25]的研究方法制備松籽油。取5 g松仁粉末，置于11 倍體積的正己烷中，浸提35 min后抽濾，得到抽濾后的溶液，45 ℃旋轉蒸發回收正己烷，得到松仁油，4 ℃冷藏待用。

1.3.2 樣品頂空前處理條件

取5 mL松籽油放入樣品瓶中，60 ℃水浴中平衡10 min，將老化好（預先插入約200 ℃氣相檢測口處加熱約5 min）的萃取針頭插入樣品瓶中，將石英纖維頭暴露于樣品瓶的頂空氣體中，恒溫60 ℃萃取45 min，用手柄將纖維頭推回針頭內拔出，插入GC-MS的進樣器于250 ℃解吸1 min，同時啟動儀器采集數據。

1.3.3 GC條件

進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min。采用程序升溫方式，40 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min升至230 ℃，保持13 min，不分流進樣。

1.3.4 MS條件

MS離子源225 ℃全掃描，電離方式為電子電離源（electron impact，EI），電子能量70 eV；掃描質量范圍m/z50～500。

1.3.5 E-nose傳感器檢測

取10 mL松籽油于15 mL頂空瓶中，用聚四氟乙烯隔墊密封，放在E-nose儀器的托盤上按設置的條件待測。E-nose條件：頂空產生溫度60 ℃，頂空產生時間600 s、載氣流速400 mL/min、進樣體積5.0 mL、進樣速率2.5 mL/s。傳感器信號分析：E-nose共有10 個傳感器，檢測每個樣品時共采集90 s。E-nose編號及其對應敏感物質信息見表1。

表1 PEN3 E-nose傳感器敏感物質Table 1 PEN3 E-nose sensors sensitive to various volatile substances

1.4 數據處理

對GC-MS總離子流圖的各峰經MS計算機數據系統檢索及核對Nist 2.2譜庫，僅保留匹配度大于800（最大值1 000）的鑒定結果，用峰面積歸一化法計算各揮發性成分的相對含量。E-nose根據傳感器采集的原始數據進行統計學分析，檢測結果由儀器自帶的Win Muster軟件進行PCA和LDA。單因素試驗每次做3 個平行樣，采用SPSS 19.0軟件處理數據，并采用單因素方差分析比較均值，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 揮發性成分分析

揮發性成分是決定消費者對食用植物油品質的接受和偏好程度的重要特征，且影響植物油整體風味[26]。為比較和評價不同品系紅松籽油的揮發性成分，采用HS-SPME-GC-MS對10 種優良品系松籽油樣品進行揮發性成分分析。

10 種松籽油通過HS-SPME-GC-MS分析，共鑒定163 種揮發性物質。其中包含7 種類型的揮發性物質：烴類（62 種）、醇類（19 種）、醛類（10 種）、酯類（24 種）、酮類（14 種）、酸類（19 種）、其他（10 種）。此發現與楊春英等[27]研究多種植物油揮發性風味成分的結果相似，說明植物油的香味不是由一種或幾種化合物組成，而是由多種類型的化合物協同作用，體現不同的特征香味。烴類、醛類、醇類和酯類相對含量明顯高于其他類型的揮發性物質，這4 類物質是松籽油中主要揮發性物質，約占總揮發性成分的72.59%，而且這些化合物種類大多數存在差異，樣品1、5、6、7、9均高于平均值，其中樣品5（80.05%）最高，為80.05%，樣品8（60.73%）。

烴類物質共有62 種，飽和烴類物質在總揮發性物質中占比雖然很大，但烴類整體閾值較高，所以風味貢獻不大。烴類相對含量占12.26%～20.07%，2-甲基-戊烷與3-甲基-戊烷在10 種松籽油中均存在，且每個品系中3-甲基-戊烷含量均高于2-甲基-戊烷。(-)-β-蒎烯、檸檬烯、莰烯在紅松松針[28]和松殼[29]的揮發油和杜松籽油[30]的風味物質研究中也均有發現。

醛類是植物油中重要的揮發性成分，多數醛類一般產生較好的風味，主要有油脂味、堅果味和青草味，但醛類也可能具有毒性，如(E,E)-2,4-癸二烯醛被認為是致癌物質或可疑致癌物[31]。醛類物質相對含量占12.99%～20.20%，除樣品4、8、10外，(E,E)-2,4-癸二烯醛在其余7 個樣品中均檢測到，其中樣品5相對含量最高，約占醛類的50%，其次為樣品3、6。但在樣品4、8、10中檢測到3-甲基-2-丁醛相對含量較高，分別為4.75%、4.02%、4.55%。楊春英等[27]對葵花籽油、玉米油等多種食用油的揮發性成分研究發現，同種食用油（除橄欖油[32]）可同時檢測到辛醛和壬醛，但本研究中10 種松籽油均未同時檢測到。丙醛、5-乙基環戊-1-烯甲醛在松籽油中含量較少，僅在個別品種可檢測到。

醇類揮發性物質源于油脂中不飽和脂肪酸的生物降解，而且醇類物質是生成酯類物質的主要前體物質。主要通過脂肪酶作用、羰基化合物還原合成醇類物質，其氣味柔和、有植物香味，其氣味閾值較高，僅能貢獻微弱的清香味[10]。10 個樣品中醇類物質相對含量占12.26%～24.07%，除樣品8外，醇類物質均以環己醇、2-環己烯-1-醇、3-己烯-1-醇和2-己烯-1-醇為主，其均貢獻出藥草香味。樣品8的醇類物質主要以1-十二烯-3-醇、環戊醇為主，且其相對含量最低，此差異的原因可能為紅松籽的品種不同。

樣品中酸類物質相對含量較少，僅含0.43%～9.19%，其中主要是乙酸和壬酸。乙酸主要通過脂氧合酶路徑的酶解反應產生，其具有油脂腥味，可能對松籽油青腥味有一定影響，且乙酸可以通過酯的形式與糖結合[33]，促進風味的形成。酯類物質主要通過脂肪酸分解產生，不同食用油酯類差異較大，大多數的酯類化合物均有甜味。酯類物質占19.02%～25.81%，其中主要以乙酸乙酯為主，相對含量為5.39%～10.01%，其中樣品6最低，樣品4最高。酮類揮發性物質主要來源于多不飽和脂肪酸的熱降解或β-氧化，其一般具有花香和果香[34]，其相對含量為7.38%～12.38%，樣品7相對含量最低，樣品8最高。

綜上，10 種松籽油揮發性成分具有一定差異，主要貢獻風味的物質為醛類、醇類和酯類，其主要為2,4-癸二烯醛、3-甲基-2-丁醛、辛醛、壬醛、環己醇、2-環己烯-1-醇、3-己烯-1-醇和2-己烯-1-醇、1-十二烯-3-醇、環戊醇和乙酸乙酯。這些物質閾值比較低，對風味貢獻極大。而一些烯烴類物質雖然含量很少，但可對風味的形成產生一定的影響，此類物質與脂肪酸的烷氧基均裂有關，可提高油脂的整體風味。

如圖1所示，10 種松籽油中烴類物質數量最多，約占總數量的30%。酯類物質次之，醛類與酮類物質數量基本持平。鑒定總揮發性風味物質個數的大小關系為：樣品1＞樣品3=樣品6＞樣品2=樣品7=樣品10＞樣品8=樣品9＞樣品4＞樣品5。6 種松籽油的總揮發性物質數量超過其平均值，分別為樣品1、3、6、2、7和10，總揮發性物質個數依次為71、65、65、64、64和64 個。

圖1 10 種松籽油的揮發性風味物質種類數Fig.1 Number of volatile compounds in 10 pine nut oils

由圖2可知，烴類物質種類雖然最多，但其相對含量卻不高，其中酯類和醇類相對含量高于其他種類。除樣品7外，所有樣品鑒定揮發性物質相對含量中的酯類高于其他類物質，其中，樣品1、5、8和9鑒定酯類的相對含量較高，均值分別為24.90%、25.81%、23.22%和24.01%。樣品7（19.02%）在所有品系的酯類物質相對含量最低。樣品1、2、7、10中鑒定的醇類物質數量較多，分別為14、11、11、11 個，其中樣品7（24.07%）中醇類的相對含量最高。所有品系中醛類物質數量僅次于其他類物質，但揮發性成分相對含量均值占總數的16.33%，相對含量均值高于酸類（13.75%）、醛類（9.66%）和其他類（3.92%）。樣品3、4、6、7、9分別鑒定烴類物質27、22、22、22、24 種，高于其他品系中烴類物質的數量，其中樣品7（20.07%）中烴類相對含量最高；樣品6（19.01%）次之。因此，10 種松籽油中揮發性物質含量及其所屬種類及其數量存在一定的差異性。

圖2 10 種松籽油的揮發性風味物質相對含量Fig.2 Relative contents of volatile compounds in 10 pine nut oils

2.2 揮發性成分聚類分析和PCA

聚類分析是描述不同品種間差異的方法，反映揮發性特征相似的紅松籽油在一定程度上的同質性，而不同的聚類則反映不同的相似性[35]。本研究采用以歐氏距離為度量的群間連鎖法進行聚類分析，合并后數據以樹狀圖形式呈現。

如圖3所示，將含有相似特征成分的樣品集合為一組，根據紅松籽油的揮發性成分組成和含量，將10 個不同的樣品明顯分為3 類。樣品2、3、4、8、10為第1類，此類的酸類、酮類成分含量高于另外兩類；樣品6、7為第2類，烴類含量較高；樣品1、5、9為第5類，酯類、醛類含量較高。由圖4可知，PCA提取2 個PC，累計貢獻率為75.7%，可以較好地反映松籽油的揮發性成分。所有樣品分離很好，根據所處象限位置將樣品分成3 類的結果與聚類分析結果一致，樣品2、3、4、8、10在PC1上呈負向分布，樣品6、7在PC2上呈正向分布，樣品1、5、9在PC1和PC2中均為正值，同一類樣品揮發性成分含量及組成均具有相似性，說明品種是影響揮發性成分含量及其組成的決定因素。此結果對于選擇加工品種以制備特定口味和香味的調味松籽油具有重要作用。

圖3 10 種紅松籽油揮發性成分聚類分析Fig.3 Dendrogram for clustering analysis of volatile components in 10 pine nut oils

圖4 10 種紅松籽油揮發性成分PCAFig.4 PCA plot of volatile components in 10 pine nut oils

2.3 E-nose分析10 種紅松籽油揮發性成分

E-nose根據一系列的化學氣體傳感器，結合多元統計學方法獲得樣品中揮發性化合物的完整信息，但得不到定性、定量的結果[36]。根據10 種紅松籽油在10 個傳感器上的響應值得出松籽油雷達指紋圖如圖5所示。

圖5 10 種紅松籽油的氣味雷達指紋圖Fig.5 Odor radar fingerprints of 10 pine nut oils

圖5可比較E-nose對不同品系松籽油響應值的差異，結合表1可知，R1、R3、R4、R5、R10傳感器對樣品的響應值較小，而R2、R6、R7、R8、R9傳感器對不同品系松籽油的響應值最大，說明樣品對氮氧化物、氫氧化合物、烷類、硫化物和芳香成分的靈敏度較理想。10 個樣品在R2、R6、R7、R8、R9傳感器的信號響應值有差異，表明這5 個傳感器檢測的揮發性成分組成相差較大，而10 個樣品在其余5 個傳感器的信號響應值幾乎重疊，因此這5 個傳感器檢的揮發性成分組成基本相似。樣品7的雷達響應圖和其他種類松籽油具有差異，對比圖2發現樣品7的酯類和醛類物質含量較低，烴類和醇類物質含量最高，這可能是與其他種類差異較大的原因。

PCA統計方法是將一組可能有相關性的變量通過正交變換的方法轉為一組線性不相關變量[34]。圖6為10 種松籽油E-nose數據的PCA二維圖，PC1、PC2貢獻率分別為93.05%、4.12%，總貢獻率達97.17%，基本涵蓋樣品的所有信息，用其代表松籽油的E-nose整體信息可信度非常高。除樣品1、2與樣品4、6部分重疊外，其他種類松籽油分離得很好。樣品7與其他種類距離較遠，說明和其他種類相差很大，這與E-nsoe雷達指紋圖表達的信息一致。

圖610 種紅松籽油的E-nose PCA二維圖Fig.6 Two-dimensional PCA plot of E-nose data of 10 pine nut oils

圖710 種松籽油的E-nose LDA二維圖Fig.7 Two-dimensional LDA plot of E-nose data of 10 pine nut oils

運用LDA對不同品系的紅松籽油樣品進行鑒別。LDA比PCA更注重樣品在空間的分布狀態及彼此之間的距離分析，此方法讓類間散布矩陣最大，同時類內散布矩陣最小，能更好地分析樣品間的差異性[37]。由圖7可知，LD1和LD2的貢獻率分別為81.49%和7.33%，前2 種PC的累計貢獻率達88.82%，大于85%，能很好地區分不同品系紅松籽油，且分別將樣品1和樣品2、樣品4和樣品6分離，區分效果比PCA更好。因此，結合PCA、LDA方法，可彌補PCA對不同類別樣品不敏感及LDA算法處理小規模樣本的缺憾，進而得到更好的分類效果。因此，在評定不同品系松籽油的揮發性成分時，應綜合2 種方法進行分析。

PCA與LDA方法能高效地區分10 種品系的松籽油在揮發性風味成分種類和含量的差異，其中樣品7與其他樣品間差別較大，樣品1和樣品2、樣品4和樣品6共2 組的分離效果欠佳，通過LDA對其進行區分，且分離效果良好。

2.4 E-nose和GC-MS的相關性分析

選擇每個種類中前5 種相對含量較高的揮發性化合物進行熱圖分析[38]，結果如圖8所示。10 個樣品中，乙酸乙酯、乙酸、3-甲基-戊烷和月桂烯醛是主要化合物。不同品系紅松籽油揮發性化合物的組成具有差異性和相似性，樣品4、10、8、6具有相似的風味成分，樣品3、5與其他樣品差異較明顯。此外，2,4-癸二烯是樣品6相對含量最高的揮發性化合物。(+)-檸檬烯是樣品9中相對含量最高的揮發性化合物。

圖8 10 種松籽油揮發性化合物的熱圖Fig.8 Heatmap of the key volatile compounds in 10 pine nut oils

選擇GC-MS熱圖分析中較為豐富的揮發性成分，與E-nose傳感器信號進行相關性分析，結果如圖9所示。R3、R4、R5和R10傳感器的信號強度分別與3-甲基-丁醛、1,4-苯二醇、3-甲基-戊烷和甲酸的豐度相對含量呈高度正相關，這表明R3、R4、R5和R10傳感器對碳氫化合物和芳族化合物敏感。相反，R7的信號強度與1,4-苯二醇的相對含量呈負相關，R8和R9信號強度與環己醇的相對含量呈負相關。R1、R2和R6傳感器與醛類揮發性化合物具有一定相關性，R1、R2傳感器均與十六醛相對含量呈正相關。表明E-nose能夠通過對松籽油的揮發性化合物做特殊反應以區分其類別。

圖9 10 種松籽油中主要揮發性組分、E-nose和GC-MS之間的相關性Fig.9 Correlation between E-nose and GC-MS data of the key volatile components in 10 pine nut oils

3 結 論

HS-SPME-GC-MS結合E-nose可對不同品系紅松籽油揮發性物質進行區別和分類。烴類、醛類、醇類和酯類為10 個品系紅松籽油的主要揮發性物質。HS-SPMEGC-MS結合E-nose的方法證明不同品系紅松籽油對其揮發性物質影響顯著，這2 種技術的相關性分析結果表明，E-nose傳感器與不同揮發性物質有相關性，能夠通過揮發性物質區分其類別。HS-SPME-GC-MS技術結合E-nose用于區分和比較10 個品系紅松籽油的揮發性成分具有理想的可行性。