瑞士乳桿菌對契達干酪成熟期間所產ACE抑制肽的影響及其消化穩定性

郝欣悅，李曉東*，劉 璐*，張秀秀，楊婉霜，張更旭，王 東

（東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

干酪在成熟過程中，會發生一系列復雜的生化反應，一些蛋白酶或肽酶水解蛋白生成多種生物活性肽，這些肽主要是含有2～20 個氨基酸殘基的片段，具有抑菌、免疫調節、抗高血壓和抗氧化等生物活性，可以影響免疫系統和心血管系統等主要人體系統，因此干酪具有較高的營養價值[1]。而契達干酪由于具有較長的成熟期，常被用于生物活性肽的研究。

近年來，益生菌干酪越來越受到關注。干酪的基質緊密，脂肪含量高，氧含量低，可以作為益生菌的完美載體[2]。Dimitrov等[3]瑞士乳桿菌A1同其他乳酸菌相比具有較高的血管緊張素轉換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制活性和良好的工藝性能，如快速酸化、生產芳香物質和較強的蛋白質水解活性，適合作為干酪發酵劑[3]；Baptista等[4]發現瑞士乳桿菌作為附屬發酵劑加入到普拉托干酪中有助于水解β-酪蛋白（β-caseinate，β-CN）產生生物活性肽，尤其是ACE抑制肽β-CN（f 194-209）；Sahingi等[5]發現將瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌加入到白鹵干酪中，加速蛋白質水解并促進ACE抑制肽的產生；添加鼠李糖乳桿菌489的荷蘭型干酪在成熟期間的蛋白質水解程度和ACE抑制活性顯著高于不添加益生菌的干酪[6]，但益生菌干酪成熟期間所產ACE抑制肽的一般趨勢尚不明確。

此外，生物活性肽可能在攝入后被胃腸蛋白酶降解，進而引發結構及活性方面的變化。目前Martini等[7]發現帕米吉亞諾干酪經過胃腸消化后ACE抑制肽的活性升高，數量增加，而Barac等[8]發現傳統塞爾維亞白鹵干酪體外消化后ACE抑制活性降低。所以有關消化對干酪ACE抑制活性的影響尚無明確規律。

因此，本實驗以干酪乳桿菌組、鼠李糖乳桿菌組和空白組干酪作為對照，研究成熟時間及消化對瑞士乳桿菌契達干酪ACE抑制活性的影響，以期對益生菌干酪所產ACE抑制肽的生成機制及功能性干酪的開發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳 黑龍江哈爾濱市香坊農場完達山奶源基地；瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）1.0612、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）1.0911、干酪乳桿菌（L.casei）1.0319 東北農業大學乳品重點實驗室的菌種庫；商業發酵劑（Lactococcus lactissubsp.cremoris和Lactococcus lactissubsp.lactis混合菌種）、凝乳酶Stamix 1150 北京科漢森公司；胃蛋白酶（1∶10 000 U/mg）、胰蛋白酶（1∶250 U/mg）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質定量試劑盒北京索萊寶科技有限公司；ACE（0.25 UN） 德國Sigma公司；N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanylglycyl-glycine，FAPGG） 上海麥克林生化科技有限公司；MRS肉湯、MRS培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司。以上菌株和商業發酵劑于-20 ℃保存。

1.2 儀器與設備

K9840自動凱氏定氮儀 山東海能科學儀器有限公司；SYQDSX-280B手提式蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；3k15離心機 德國Sigma公司；ULTRATURRAX T8均質機 德國IKA公司；數顯恒溫水浴箱上海比朗儀器有限公司；INFINITE M200 PRO多功能酶標儀 帝肯（上海）貿易有限公司；SHA-B恒溫振蕩器常州智博瑞儀器制造有限公司；Whatman No.41、No.42濾紙 通用電氣生物科技（杭州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與培養

將200 μL的菌種接種于5 mL的MRS肉湯中，在37 ℃厭氧培養17～18 h，活化2 代，再按4%（V/V）接種量接種于60 mL 12%（m/m）的脫脂乳培養基中，培養1 代后活菌數為9（lg（CFU）/g）左右，備用。

1.3.2 契達干酪的制作

參考陳萍等[9]的干酪制作方法，生產4 批契達干酪。第1批（batch-1，B-1）：只加入0.01%（m/m）發酵劑；第2批（batch-2，B-2）：加入0.005%（m/m）發酵劑、1.2%（V/V）干酪乳桿菌；第3批（batch-3，B-3）：加入0.005%發酵劑、1.2%（V/V）鼠李糖乳桿菌；第4批（batch-4，B-4）：加入0.005%發酵劑和1.2%（V/V）瑞士乳桿菌。每批干酪制作完成，4 ℃成熟8 個月。

1.3.3 干酪益生菌活菌數的測定

分別于0（即做好的新鮮干酪，未成熟）、1、2、3、4、5、6、7、8 個月取樣進行分析。將5 g契達干酪放入45 mL 2%（m/m）檸檬酸鈉中，在均質機中10 000 r/min均質2 min，用滅菌的0.1%蛋白胨稀釋，取0.1 mL稀釋液涂布于MRS培養基，在37 ℃厭氧培養48 h后進行計數，結果以lg（CFU/g）表示。

1.3.4 蛋白水解度的測定

1.3.4.1 pH 4.6醋酸鹽緩沖液測定可溶性氮（soluble nitrogen，SN）含量

參考Hou Jia等[10]的方法略作修改。分別于0、1、2、3、4、5、6、7 個和8 個月取樣進行分析。取50 g干酪，加入100 mL pH 4.6的醋酸鹽緩沖液（醋酸-醋酸鈉溶液）攪拌均勻，60 ℃保溫1 h，懸浮液于4 ℃、4 000 r/min離心20 min，取中層清液定量移入消化瓶進行凱氏微量定氮，總含氮量按GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》[11]進行凱氏微量定氮，按式（1）計算SN質量分數：

式中：C1為pH 4.6時凱氏微量定氮法測得SN質量分數/%；C0為無前處理步驟、僅用凱氏定氮法測得干酪的總SN質量分數/%。

1.3.4.2 三氯乙酸（tricholoracetate acid，TCA）測定SN含量

參考Giannoglou等[12]的方法略作修改。取上述上清液16 mL，加入4 mL 12%（m/m）的TCA溶液，靜置1 h，于4 ℃、4 000 r/min離心20 min，取上清液定量地移入消化瓶進行凱氏微量定氮，總含氮量按GB 5009.5—2016進行凱氏微量定氮，按式（2）計算SN質量分數CTCA：

式中：C2為TCA測得SN質量分數/%；C0為無前處理步驟、僅用凱氏定氮法測得干酪的總SN質量分數/%。

1.3.4.3 5%磷鎢酸（phosphotungstic acid soluble nitrogen，PTA）法測定SN含量

參考Giannoglou等[12]的方法略作修改。取5 mL 1.3.4.1節所得濾液，加入3.5 mL 4 mol/L硫酸溶液和1.5 mL質量濃度0.33 g/mL PTA溶液混合均勻，4 ℃過夜，通過Whatman No.42濾紙過濾，取10 mL濾液定量地移入消化瓶進行凱氏微量定氮，總含氮量按GB 5009.5—2016進行凱氏微量定氮，按式（3）計算SN質量分數CPTA：

式中：C3為PTA法測得SN質量分數/%；C0為為無前處理步驟、僅用凱氏定氮法測得干酪的總SN質量分數/%。

1.3.5 干酪水溶性提取物（water-soluble extract，WSE）的制備

分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 個月取樣制備干酪WSE。將50 g干酪搗碎，加適量蒸餾水混合，在37 ℃水浴30～60 min，然后用均質機8 000 r/min均質3 min，再以12 000 r/min均質1～2 min，撇去表層油脂，于4 ℃、6 000 r/min離心20 min。懸浮液通過Whatman No.41濾紙過濾，濾液再次離心、過濾。濾液進行冷凍干燥并-20 ℃保存。

1.3.6 ACE抑制活性測定

參照楊雪等[13]的方法稍有修改。取20 μL 0.1 U/mL ACE放入酶標板中，然后分別在對照孔和樣品孔加入40 μL 80 mmol/L羥乙基哌嗪乙烷磺酸緩沖液（pH 8.3）、質量濃度15 mg/mL ACE抑制劑（樣品溶液），最后向各孔加入50 μL預熱的1 mmol/L FAPGG，立即混勻。在340 nm波長處測定對照孔和樣品孔的初始吸光度，然后于37 ℃避光保溫30 min再測定其吸光度，每個樣品重復測定3 次。按式（4）計算樣品ACE抑制率：

式中：ΔA樣品和ΔA對照分別表示樣品組和空白組兩次測定吸光度的變化值。

1.3.7 體外模擬胃腸消化

1.3.7.1 干酪體外模擬胃腸消化

選取ACE抑制活性最高成熟時期的干酪進行胃腸消化。含0.2%（m/m）NaCl和0.35%（m/m）胃蛋白酶的人工胃液，用1 mol/L HCl溶液調pH值為2.0±0.1后，過濾除菌備用。將10 g干酪放入90 mL人工胃液中，充分溶解后放入37 ℃、120 r/min恒溫振蕩水浴鍋模擬胃消化3 h。消化結束時，取樣1 mL用于活菌計數，剩余消化液在沸水浴中加熱5～10 min滅酶。待冷卻到室溫后，49 mL取樣，剩余50 mL用1 mol/L NaOH溶液將pH值調到7.5±0.1，再加入胰蛋白酶（酶底比1∶20，m/m），混勻后放入37 ℃、120 r/min恒溫振蕩水浴鍋模擬腸消化4 h。消化結束時取樣1 mL，剩余消化液沸水浴加熱5～10 min滅酶后冷卻至室溫。胃消化物和腸消化物于4 ℃、12 000×g離心10 min，收集上清液，冷凍干燥并-20 ℃保存。

1.3.7.2 不同分子質量干酪WSE體外模擬胃腸消化

將1.3.5節得到的4 組干酪WSE溶液分別用10、3 kDa超濾離心管，于4 ℃、6 500 r/min超濾20 min后，得到3 個組分（F1分子質量小于3 kDa、F2分子質量在3～10 kDa之間、F3分子質量大于10 kDa）。取9 mL各組分溶液，加入1 mL人工胃液，混勻后模擬胃消化。消化結束后沸水浴滅酶，冷卻后取樣測定ACE抑制活性，調節剩下樣品的pH值為7.5±0.1，加入胰蛋白酶模擬腸液消化。消化結束后沸水浴滅酶，冷卻后取樣測定ACE抑制活性。

1.3.8 干酪中多肽質量濃度變化的測定

采用BCA蛋白試劑盒測定多肽質量濃度，將干酪WSE和胃腸消化產物配成15 mg/mL的溶液并稀釋相應倍數，根據試劑盒方法在562 nm波長處測定吸光度。實驗中以牛血清白蛋白溶液作為蛋白質標準品，以其質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，根據回歸方程計算多肽質量濃度。

1.3.9 干酪的感官評價

參照Liu Lu等[14]的方法進行感官評價，且略有改動。由12 名專業人士（男性、女性各6 名，年齡在25～40 歲）對干酪的色澤（乳白色或乳黃色、光澤度）、風味（奶香味、酸味、苦味）、口感（細膩、沙礫感）、組織狀態（均勻性、硬度）和整體可接受性（色澤、風味、口感、組織狀態的總體滿意度）進行評價，根據嗜好程度評分分為5 個等級（1～2 分為差、3～4 分為一般、5～6 分為好、7～8 分為很好、9～10 分為極好）。每個樣品隨機分給評委，最后以平均分進行結果分析。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 干酪成熟過程中的益生菌活菌數測定結果

由圖1可知，B-1～B-4組干酪的活菌數成熟1 個月時達到最大值，其分別為9.51、9.73、9.65、9.73（lg （CFU/g）），然后逐漸下降，其原因可能為干酪較高的含鹽量，且在干酪成熟期間，營養物質減少、缺乏碳源，乳糖發酵形成乳酸降低環境的pH值，因而菌體自溶[15-16]。益生菌干酪的活菌數顯著高于空白組（P＜0.05），表明添加益生菌對干酪中活菌數的水平有顯著影響，進而影響蛋白水解度、ACE抑制活性[17]。其中，瑞士乳桿菌組干酪在成熟期間活菌數最高，但與其他益生菌組無顯著差異（P＞0.05），說明3 種益生菌在干酪中的存活能力相當。在成熟末期，3 組益生菌干酪的活菌數均大于7（lg（CFU/g）），因此其均屬益生菌食品[9]。

圖1 干酪成熟期間活菌數Fig.1 Number of viable bacteria during cheese ripening

2.2 干酪成熟過程中的蛋白水解

2.2.1 干酪成熟過程中pH 4.6醋酸鹽緩沖液測得SN含量變化

由圖2可知，成熟期內B-1～B-4組干酪pH 4.6醋酸鹽緩沖液測得SN質量分數逐漸增加，最終分別達到22.03%、24.56%、25.58%、26.78%。其中，在成熟的前4 個月，同一時期益生菌干酪與空白干酪的SN水平差異不顯著（P＞0.05），在此成熟期間可能發生由殘留凝乳酶造成的初級蛋白水解[18-19]。但成熟5 個月后，相同時期內，益生菌干酪的SN含量顯著高于空白組（P＜0.05），其原因可能為益生菌的添加促進干酪中的蛋白水解。

圖2 干酪成熟過程中pH 4.6條件下SN含量的變化Fig.2 Content of pH 4.6-SN during cheese ripening during cheese ripening

2.2.2 干酪成熟過程中TCA法測得SN的含量變化

由圖3可知，整個成熟期間4 組干酪的TCA法測定SN含量呈現升高趨勢，成熟的3 個月內，同一成熟時期，4 組干酪的SN水平差異不顯著（P＞0.05），但從成熟的第4個月開始，更多初級蛋白水解產物成為后續乳酸菌肽酶水解的底物，產生更多的分子質量低于3 kDa的肽段和游離氨基酸，從而導致干酪SN水平顯著增加[19-20]（P＜0.05）。在成熟期結束時，B-1～B-4的SN質量分數分別為18.52%、20.52%、22.22%、23.88%。

圖3 干酪成熟過程中TCA法測得SN含量的變化Fig.3 Contents of TCA-SN during cheese ripening

2.2.3 干酪成熟過程中PTA法測得SN的含量變化

如圖4所示，成熟期4組干酪的PTA法測定SN含量呈升高趨勢，在干酪成熟的3 個月內，同一時期4 組干酪的SN含量無明顯差異（P＞0.05），到第5個月，益生菌干酪的SN含量明顯高于空白組（P＜0.05），其原因可能為益生菌細胞內肽酶水解蛋白的活性增強，因而產生更多的小分子肽（小于600 Da）、游離氨基酸[14,21]。成熟8 個月后，B-1～B-4的SN質量分數分別達到9.25%、10.50%、11.17%、12.16%。

圖4 干酪成熟過程中PTA法測得SN含量的變化Fig.4 Contents of PTA-SN during cheese ripening

綜上所述，益生菌可以促進蛋白水解。其中，瑞士乳桿菌干酪的蛋白水解水平顯著高于其他3 組干酪，說明瑞士乳桿菌具有最強的蛋白水解活性；而鼠李糖乳桿菌干酪與干酪乳桿菌干酪的蛋白水解能力差異不顯著（P＞0.05），說明2 種菌株的蛋白水解能力相近，蛋白水解能力的差異可反映不同益生菌間蛋白酶、肽酶，及轉錄調控的差異[22]。

2.3 干酪成熟過程中的ACE抑制活性變化

如圖5所示，B-1～B-4組干酪的ACE抑制活性隨成熟時間的延長而逐漸增高，在第6個月達到最大值，分別為66.21%、73.35%、75.02%、79.71%，隨后開始下降，此現象與Ryh?nen等[23]的研究結果相似，其原因可能為干酪成熟過程中一些ACE抑制肽可被蛋白酶和乳酸菌釋放的肽酶進一步降解為較短、不活躍的片段[24]。益生菌干酪的ACE抑制活性顯著高于空白組（P＜0.05），其對應關系為瑞士乳桿菌干酪＞鼠李糖乳桿菌干酪＞干酪乳桿菌干酪，這種差異可能與不同益生菌產生的特異性胞壁蛋白酶或肽酶有關[24]，El-Fattah等[25]報道瑞士乳桿菌具有最高的蛋白水解活性及ACE抑制活性。肽經過胃腸消化后，其ACE抑制活性可能會降低，為了保證消化后的ACE抑制肽活性能在一定水平之上，因此選擇活性最高的時期，即6 個月的干酪模擬胃腸消化。

圖5 干酪成熟期間的ACE抑制活性變化Fig.5 ACE inhibitory activity during cheese ripening

2.4 干酪經模擬胃腸道消化益生菌的活菌數變化

成熟6 個月的干酪模擬胃腸消化后益生菌的活菌數數據如表1所示。體外模擬消化后，B-1～B-4組干酪的活菌數分別下降24.10%、13.81%、17.00%、14.30%，但益生菌干酪的活菌數仍然在6（lg （CFU/g））以上，說明干酪中的益生菌經模擬胃腸消化后具有良好的存活率，且能在腸道中發揮益生功能[26]。高活菌數的原因可能為干酪的脂肪含量高、基質緊密的2 個特點賦予其在胃腸道中較高的緩沖能力，可以提高細菌在胃、腸道環境中的存活率[27]。

表1 干酪消化前后益生菌活菌數、多肽質量濃度與ACE抑制活性Table 1 Number of living probiotic bacteria, polypeptide content and ACE inhibitory activity of cheese during simulated gastrointestinal digestion

2.5 干酪經模擬胃腸消化多肽質量濃度變化

以牛血清蛋白為標準物質，建立牛血清蛋白質量濃度與吸光度間的關系，回歸方程為y=1.299x+0.145 8，R2=0.997 9，因此二者具有良好的線性關系。由表1可知，體外模擬消化后B-1～B-4組干酪的多肽質量濃度分別增加25.29%、38.86%、32.96%、56.11%，Sánchez-Rivera等[28]也說明模擬胃腸消化可產生更多的生物活性肽。其中，益生菌干酪多肽質量濃度顯著高于空白組（P＜0.05），其原因可能為益生菌產生的二肽酶、三肽酶、羧肽酶、氨基肽酶、內肽酶對干酪中蛋白質的進一步水解，產生更多多肽[29]。

2.6 模擬胃腸道消化對干酪ACE抑制活性的影響

如表1所示，模擬消化后B-1～B-4組干酪的ACE抑制活性顯著升高（P＜0.05），其可能原因為消化過程中蛋白質的進一步水解，產生更多高活性的ACE抑制肽。其中，B4組干酪經胃消化后活性高于腸的消化后活性，其原因可能為分子質量大的肽段在胃蛋白酶作用下水解，且產生大量ACE抑制活性高的肽段，而腸消化后活性的下降則歸因于小分子肽段的過度水解。然而，B1～B3組干酪經腸液消化后的活性均高于胃液消化后的活性，推測其可能原因為胃蛋白酶消化的物質會被胰蛋白酶分解成更小的肽和氨基酸[30]，具有ACE抑制活性。瑞士乳桿菌干酪與其他組干酪消化后活性變化不同，其原因可能為添加瑞士乳桿菌會產生不同結構的ACE抑制肽，此現象需進一步研究。

2.7 不同分子質量多肽在胃腸消化前后的ACE抑制活性

如表2所示，消化前小于3 kDa的組分均具有最強的ACE抑制活性，而大于10 kDa的組分活性最低。表明分子質量越小的肽段，其ACE抑制活性越高，其原因可能為高分子質量肽段的復雜空間結構，具備ACE抑制活性的氨基酸無法暴露，進而無法發揮其降壓的作用[31-32]。

表2 不同分子質量的超濾組分ACE抑制率Table 2 ACE inhibitory activity of polypeptides with different molecular masses

消化后分子質量小于10 kDa超濾組分的ACE抑制活性下降，其原因可能為干酪多肽活性與氨基酸組成和空間結構有關，在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下，分子質量小于10 kDa的肽段由于消化酶過度水解，空間結構被破壞，因而降低甚至剝奪肽段的較高ACE抑制活性[32]；而分子質量大于10 kDa組分的ACE抑制活性升高，其原因可能為大于10 kDa的肽段被水解，導致多肽含量的增加，且釋放活性較高的肽段，因而活性增強。Chen Min等[33]發現人類消化道中各種消化酶對多肽的水解作用可能導致多肽的生物活性發生變化。

2.8 感官評價結果

成熟8 個月的契達干酪的感官評價結果如圖6所示，瑞士乳桿菌干酪的風味評分和整體可接受性高于其他干酪，其原因可能為瑞士乳桿菌的蛋白水解能力更強，對酪蛋白結構的破壞作用更大，增加總游離氨基酸的含量，進而產生風味、芳香物質[34]。此外，空白組干酪在口感和組織狀態上評分更高，其原因可能為益生菌干酪酸值較高，進而產生更酸的口感和柔軟的質地[12]。

圖6 干酪成熟8 個月感官評價結果Fig.6 Sensory analysis of cheese after eight months of ripening

3 結 論

本研究發現益生菌可提高契達干酪成熟期的蛋白質水解程度、ACE抑制活性和益生菌活菌數，其中瑞士乳桿菌干酪具有最強的ACE抑制活性和蛋白質水解能力，且二者均顯著高于其他干酪組（P＜0.05）。模擬消化后，瑞士乳桿菌干酪的益生菌活菌數下降，而多肽質量濃度和ACE抑制活性顯著升高（P＜0.05），同時分子質量大于10 kDa的組分活性增加，表明瑞士乳桿菌蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶能產生更多的低分子質量的肽，從而導致ACE抑制活性增加。此外，添加瑞士乳桿菌不影響干酪的整體可接受性。因此，選用一種益生菌制作干酪時，考慮活性、風味、口感等因素，因此建議首選瑞士乳桿菌。混合使用多種益生菌的效果需進一步研究。此外，瑞士乳桿菌契達干酪消化前后的ACE抑制肽結構特征也需進一步研究。