地桿菌α-L-巖藻糖苷酶的分子改造及其在合成2’-巖藻糖基乳糖中的應用

史 然，張登婭，谷懿寰，江正強，楊紹青*

（中國輕工食品生物工程重點實驗室，中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是人乳中一系列結構復雜、不可消化的碳水化合物總稱，在嬰幼兒生長和發育過程中發揮著關鍵作用[1]。HMOs在人乳中質量濃度約為5～24 g/L，是僅次于脂肪和乳糖的第3大類固形物[2]，其中2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）（圖1）是HMOs中的最主要成分之一[3]。研究表明，2’-FL具有調節腸道微生態、抗病原菌黏附、免疫調節及促進神經系統發育和修復等多種功能活性[3]。目前，2’-FL已經在美國和歐盟獲得批準可作為食品原料添加到嬰幼兒奶粉、膳食補充劑和醫療食品中[4]。

圖1 2’-FL的分子結構Fig.1 Molecular structure of 2’-FL

2’-FL的制備主要有化學合成、全細胞合成和酶催化合成法[4-5]，其中酶法合成具有反應條件溫和、反應時間短、產物易于純化等優點，具有較好的發展前景[6-8]。α-L-巖藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）能夠催化巖藻糖苷鍵的水解，在特定條件下也能夠催化轉糖苷反應合成巖藻糖苷鍵[8]，因而在酶法合成巖藻糖基寡糖中發揮著關鍵作用[8-10]。α-L-巖藻糖苷酶來源廣泛，特性各異，其中適用于2’-FL合成的α-L-巖藻糖苷酶主要以微生物來源為主，且主要集中于細菌種屬，如地桿菌（Pedobactersp.）[11]、芽孢桿菌（Paenibacillussp.）[12]和熱袍菌（Thermotogasp.）等[13]，真菌來源相對較少，如禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）等[14]。雖然目前已有一些α-L-巖藻糖苷酶合成2’-FL的研究報道，但是受限于α-L-巖藻糖苷酶的催化特性，反應產物成分復雜、轉化率低等問題仍然亟待解決[9-10]。蛋白質工程是提高酶學性質的有效手段，近年來已成功用于不同類型酶的分子改造中[15]。目前關于α-L-巖藻糖苷酶的轉糖苷活性和區域選擇性等方面的分子改造多采用理性或半理性設計的方法[16-17]，采用定向進化技術用于提高α-L-巖藻糖苷酶合成2’-FL轉化率的研究報道相對較少，僅見Osanjo等[18]采用定向進化技術對海棲熱袍菌（T.maritima）α-L-巖藻糖苷酶進行突變和篩選，得到突變酶的轉糖苷活性從7%提高至60%。

地桿菌CAU209是由本實驗室研究人員從土壤中自行分離并保藏的1 株細菌。本團隊前期從該菌株基因組中發掘出一個地桿菌α-L-巖藻糖苷酶（PbFuc29A1）（GenBank登錄號：MN902190），并應用于2’-FL和3’-FL的合成，轉化率分別為14.5%和70.5%。由于其合成2’-FL的轉化率較低[11]，本研究擬采用定向進化技術進一步對PbFuc29A1進行分子改造，以提高其合成2’-FL的效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FastPfuDNA聚合酶 北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶、連接酶 New England Biolabs公司；Escherichia coliDH5α 上海唯地生物技術有限公司；引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母膏、胰蛋白胨 英國Oxoid公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）美國Inalco公司；β-半乳糖苷酶（7 500 LAU/g）美國Novozymes公司；2-氯-4-硝基苯基-α-L-巖藻糖苷（4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside，pNP-FUC）愛爾蘭Megazyme公司；薄層層析色譜（thin layer chromatography，TLC）硅膠板Silica gel 60 F254、β-D-乳糖美國Sigma公司；2’-FL、3-FL 法國Elicityl公司；3’-FL采用之前的方法自制[11]。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MyCycler Thermal Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀、Power Pac BasicTM型電泳儀 美國Bio-Rad公司；JY92-II超聲波細胞破碎儀 寧波新芝科器研究所；3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；1260高效液相色譜儀（配套示差折光檢測器） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1α-L-巖藻糖苷酶隨機突變體文庫的構建

采用不同濃度的Mg2+（3、5 mmol/L）和Mn2+（0.1、0.2、0.4 mmol/L）對α-L-巖藻糖苷酶基因（PbFuc29A1）進行易錯PCR擴增[19]。根據PbFuc29A1的基因序列設計引物為F：5’-TGCCGCGCGGCAGCC ATATGGCTAGCATGAAGAAACTCATCCTAATAGGC CT-3’；R：5’-TGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCTC CTATCCAATCTCCAAAACAATCACC-3’。PCR體系為50 μL：1×FastPfuDNA聚合酶緩沖液、0.2 mmol/L dATP和dGTP、1 mmol/L dCTP和dTTP、引物0.2 μmol/L、模板DNA 20 ng、FastPfuDNA聚合酶2.5 U。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，變性-退火-延伸共35 個循環；終延伸5 min。

使用膠回收試劑盒切膠回收易錯PCR擴增產物，用限制性內切酶NheI和SacI分別對載體pET-28a和基因的膠回收產物進行消化（37 ℃消化5 h），用DNA清潔回收試劑盒回收酶切后的載體和基因，利用T4 DNA連接酶連接回收的基因與線性化載體，16 ℃連接過夜，將連接產物轉入E.coliDH5α中，涂布于LB固體平板（含50 μg/mL卡納霉素）上構建突變體文庫。

1.3.2α-L-巖藻糖苷酶隨機突變體文庫的篩選

1.3.2.1 初篩

初篩參照邵澤香等[20]的方法并略有修改。在96 孔板中加入100 μL LB培養基（含50 μg/mL卡納霉素），用牙簽逐個挑取突變菌接種至96 孔板（每板接種野生型菌株為對照），于37 ℃、180 r/min培養3 h。每孔取20 μL種子液轉接至新96 孔板（每孔含180 μL LB培養基，50 μg/mL卡納霉素），37 ℃、180 r/min培養3 h后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，20 ℃、180 r/min誘導16 h。在4 ℃、3 000 r/min離心20 min獲得菌體，將菌體于-80 ℃冷凍2 h后于室溫下復融，加入100 μL 10 mg/mL溶菌酶，pH 8.0、37 ℃處理30 min，再于4 ℃、3 000 r/min離心20 min，獲得上清液即為粗酶液。

粗酶活力測定：96 孔板中依次加入10 μL酶液和100 μL 2.0 mmol/LpNP-FUC溶液，在pH 5.0、35 ℃反應30 min，每孔加入100 μL 1 mmol/L Na2CO3溶液滅活顯色，在405 nm波長處讀取OD值。篩選可檢測到酶活力（OD405nm＞0.3）的粗酶液，進行轉糖苷活性測定：反應體系中依次加入250 μL 20 mmol/LpNP-FUC、250 μL 100 mmol/L乳糖和10 μL酶液，在pH 7.0、35 ℃反應3 h。沸水浴滅活10 min終止反應，取適量產物進行TLC分析，篩選出有轉糖苷活性的粗酶液。隨后在反應產物中加入β-半乳糖苷酶，于37 ℃、pH 7.0反應3 h水解剩余乳糖，沸水浴滅活10 min終止反應，取適量產物進行TLC分析，監測乳糖的水解程度。調整反應體系pH值為4.6，加入重組α-L-巖藻糖苷酶FgFCO1水解合成產物中的2’-FL，于40 ℃、pH 4.6反應3 h，由于FgFCO1可特異性水解2’-FL，而不能水解3’-FL，轉糖苷產物中2’-FL比例越高，水解生成的乳糖和L-巖藻糖含量越高，挑選水解程度高的突變酶為陽性克隆。

1.3.2.2 復篩

將陽性克隆以1%接種量接入10 mL LB培養基（含50 μg/mL卡納霉素）進行種子液培養，于37 ℃、180 r/min培養12 h。將種子液以1%接種量轉接至50 mL LB培養基，于37 ℃、180 r/min培養至菌體OD600nm至0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，20 ℃、180 r/min誘導16 h。4 ℃、10 000 r/min離心10 min收集菌體，用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液重懸菌體，菌液于冰水浴中超聲破碎（200 W，超聲3 s，間歇4 s，120 次），4 ℃、10 000 r/min離心20 min，獲得上清液即為粗酶液。

轉糖苷活性復篩：以10 mmol/L pNP-FUC作為巖藻糖基供體、50 mmol/L乳糖為受體，加入上述α-L-巖藻糖苷酶粗酶液（0.5 U/mL），在pH 7.0、35 ℃反應3 h。反應產物煮沸10 min滅活，經0.22 μm微孔濾膜過濾，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。挑選轉糖苷產物中2’-FL轉化率升高的突變體進行后續研究。

1.3.3α-L-巖藻糖苷酶突變體（mPbFuc29A1）表達和純化

菌體的培養、誘導產酶、酶液的提取與純化參照Shi Ran等[11]的方法進行。

1.3.4 mPbFuc29A1酶活力和蛋白濃度測定

α-L-巖藻糖苷酶活力測定[21]：反應體系加入100 μL 10 mmol/LpNP-FUC、100 μL 0.05 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液（pH 5.0）和10 μL適當稀釋的酶液，在35 ℃反應20 min，加入200 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應并振蕩均勻。取200 μL加入96 孔板，測定405 nm波長處OD值。以對硝基苯酚（4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside，pNP）為標準品作標準曲線。酶活力定義：在40 ℃、pH 5.0每分鐘催化pNP-FUC水解生成1 μmolpNP所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。

使用Lowry法測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白作為標準蛋白[22]。

1.3.5 mPbFuc29A1的酶學性質分析

1.3.5.1 mPbFuc29A1的最適pH值和pH值穩定性

將mPbFuc29A1分別用50 mmol/L不同pH值的緩沖液（檸檬酸-檸檬酸三鈉，pH 3.0～5.5；磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.0～8.0；Gly-NaOH，pH 8.5～10.5）稀釋，然后在40 ℃測定α-L-巖藻糖苷酶活力，以酶活力最高點作為100%作圖。

pH值穩定性測定：使用以上不同pH值的緩沖液和磷酸氫二鈉-氫氧化鈉（pH 11.0～12.0）稀釋mPbFuc29A1，將稀釋好的酶液在30 ℃處理1～8 h，每隔1 h取樣并迅速置于冰水浴中孵育30 min，在pH 5.0、40 ℃測定mPbFuc29A1的殘余酶活力，以未處理酶液的酶活力作為100%作圖。

1.3.5.2 mPbFuc29A1的最適溫度和溫度穩定性

用50 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液將mPbFuc29A1稀釋適當倍數，然后分別在20～50 ℃和pH 5.0條件下測定α-L-巖藻糖苷酶活力，以酶活力最高點為100%作圖。

溫度穩定性測定：用50 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液將純酶液稀釋適當倍數，分別在30～50 ℃處理0～8 h，定時取樣并迅速置于冰水浴中冷卻30 min，在pH 5.0、40 ℃條件下測定mPbFuc29A1的殘余酶活力，以未處理酶的酶活力為100%作圖。

1.3.5.3 mPbFuc29A1的底物特異性和動力學常數

分別以5 mmol/LpNP-FUC、2’-FL、3-FL和3’-FL為底物，測定mPbFuc29A1酶活力，計算mPbFuc29A1對各種底物的比活力和相對酶活力。反應體系中加入100 μL含10 mmol/L巖藻糖的pNP-FUC或其他底物、100 μL 50 mmol/L pH 5.0的檸檬酸緩沖液和10 μL適當稀釋的酶液，在40 ℃、pH 5.0反應20 min，最后加熱煮沸終止反應。采用HPLC測定體系中L-巖藻糖的濃度。酶活力定義：在40 ℃、pH 5.0每分鐘催化底物水解生成1 μmolL-巖藻糖所需要的酶量，以pNP-FUC為底物時測定的酶活力作為100%。比活力（U/mg）為在40 ℃、pH 5.0每毫克純酶的活力單位數。

用50 mmol/L pH 5.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液配制0.25～0.75 mmol/L的pNP-FUC溶液，反應體系中加入200 μL上述不同濃度的pNP-FUC、10 μL適當稀釋的酶液，在40 ℃、pH 5.0反應5 min，測定酶的初始酶活力。采用GraphPad Prism7.0軟件計算米氏常數Km和最大反應速率Vmax。

1.3.6 2 ’-FL和3’-FL的酶法合成

1.3.6.1 合成條件優化

以合成產物中2’-FL含量為優化目標，對mPbFuc29A1合成2’-FL的反應條件進行單因素試驗優化，包括反應溫度（20～50 ℃）、pH值（5.0～9.0）、加酶量（0.25～2.0 U/mL）、反應時間（0～5 h）和乳糖濃度（0.1～1.0 mol/L）。所有樣品煮沸10 min終止反應，產物經0.22 μm濾膜過濾后采用HPLC分析。

1.3.6.2 2’-FL、3’-FL和L-巖藻糖的定量

采用HPLC法定量分析。色譜條件：Waters XBridge氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（72∶28，V/V），流速為0.5 mL/min，柱溫45 ℃，示差折光檢測器溫度為35 ℃。

產物的定量：以2’-FL、3’-FL和L-巖藻糖為標準品，建立2’-FL、3’-FL和L-巖藻糖含量與相應HPLC信號峰面積之間的關系曲線。根據標準曲線計算產物中2’-FL、3’-FL和L-巖藻糖的含量。2’-FL和3’-FL轉化率計算公式如下：

1.3.7 mPbFuc29A1的序列分析、定點突變和三維結構模擬

將篩選到的陽性突變體α-L-巖藻糖苷酶基因（mPbFuc29A1）測序后，與野生型基因（PbFuc29A1）進行序列比對分析，確定陽性克隆突變位點。根據突變位點信息，設計兩個單點突變體，Glu266Lys和Asp21Val。對突變體轉糖苷產物組成進行HPLC分析，確定關鍵氨基酸。

以擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）α-L-巖藻糖苷酶（PDB登錄號：2wvs）為模板（同源性29.9%），在SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）上進行建模，生成PbFuc29A1模擬結構圖，根據預測的結構信息對突變位點進行分析。利用PyMOL軟件分析氨基酸殘基間氫鍵相互作用和突變位點對蛋白質二級結構的影響。

1.4 數據分析

采用GraphPad Prism7.0軟件對相關數據進行統計分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 α-L-巖藻糖苷酶突變文庫的高通量篩選

通過調整PCR體系中Mg2+或者Mn2+濃度獲得具有合適突變率的文庫是常規手段[9]。采用不同濃度的Mg2+（3、5 mmol/L）和Mn2+（0.1、0.2、0.4 mmol/L）對α-L-巖藻糖苷酶基因（PbFuc29A1）進行易錯PCR擴增，每組突變庫隨機挑選12株菌落測序計算突變率，發現采用5 mmol/L Mg2+和0.2 mmol/L Mn2+構建文庫的突變率為0.295%，在合理突變率范圍內[20]。初篩得到524 個突變體可檢測到α-L-巖藻糖苷酶活力，水解物經TLC分析，發現有129 個突變體具有轉糖苷活性。進一步篩選出6 株轉糖苷產物能夠明顯被α-L-巖藻糖苷酶FgFCO1水解的突變體。最終得到1 個轉糖苷產物中2’-FL含量明顯升高的正向突變體酶（圖2），命名為mPbFuc29A1。

圖2 地桿菌α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1及突變體mPbFuc29A1轉糖苷產物HPLC分析圖Fig.2 HPLC analysis of the transglycosylation reaction products from PbFuc29A1 and mPbFuc29A1

2.2 mPbFuc29A1的表達及純化

經過Ni-IDA親和層析柱一步純化，得到mPbFuc29A1的電泳級純酶（圖3），該酶的純化倍數為3.41，回收率為47.7%。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）顯示該酶的分子質量約為50 kDa，與野生型PbFuc29A1分子質量一致[11]。

圖3 α-L-巖藻糖苷酶突變體mPbFuc29A1純化SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of the proteins during the purification process of mPbFuc29A1

2.3 mPbFuc29A1的酶學性質

mPbFuc29A1的最適pH值為5.0（圖4A），與PbFuc29A1一致。mPbFuc29A1在pH 6.0～9.0范圍內于30 ℃保溫8 h可保持80%以上的酶活力（圖4B）。mPbFuc29A1在pH 5.0的穩定性較差，在pH 5.0保溫2 h，殘余酶活力降至50%；在pH 11.0保溫3 h，mPbFuc29A1完全失活，而未突變酶PbFuc29A1在pH 11.0保溫3 h的殘余酶活力仍為30%左右。因此，突變后α-L-巖藻糖苷酶的pH值穩定性有所下降。mPbFuc29A1的最適溫度為40 ℃（圖4C），在30 ℃和35 ℃保溫8 h、在40 ℃保溫4 h可保持80%以上的酶活力，在40 ℃保溫8 h可保持60%以上的酶活力，在45 ℃保溫0.5 h可保持75%左右的酶活力，超過0.5 h酶活力迅速下降（圖4D）。而未突變酶PbFuc29A1在30、35 ℃和40 ℃保溫8 h可保持80%以上的酶活力，在45 ℃保溫2 h可保持60%左右的酶活力。因此，突變后的α-L-巖藻糖苷酶的溫度穩定性也有所下降。

圖4 mPbFuc29A1的最適pH值（A）、pH值穩定性（B）、最適溫度（C）和溫度穩定性（D）Fig.4 Optimal pH (A), pH stability (B), optimal temperature (C), and thermostability (C) of mPbFuc29A1

2.4 mPbFuc29A1的底物特異性和動力學常數

如表1所示，突變酶mPbFuc29A1水解pNP-FUC和3’-FL的比活力分別為20.30 U/mg和4.72 U/mg，與PbFuc29A1相比，分別降低了22.8%和52.5%；此外，mPbFuc29A1水解2’-FL的比活力提高到約3 倍，為11.70 U/mg。

表1 α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1和mPbFuc29A1底物特異性Table 1 Substrate specificity of PbFuc29A1 and mPbFuc29A1

如表2所示，mPbFuc29A1對pNP-FUC的Vmax值為25.1 μmol/（min·mg），較PbFuc29A1略有降低，Km值為0.39 mmol/L，小于PbFuc29A1的Km值（0.72 mmol/L）。

表2 α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1和mPbFuc29A1動力學參數Table 2 Kinetic parameters of PbFuc29A1 and mPbFuc29A1

2.5 2’-FL和3’-FL的合成

對mPbFuc29A1合成3’-FL和2’-FL的條件進行優化，結果表明，溫度、pH值、加酶量、反應時間和乳糖濃度對3’-FL和2’-FL的合成均有顯著影響（圖5）。其中，pH值對2’-FL合成的影響較為明顯，當pH值由5.5升高至8.0時，mPbFuc29A1合成2’-FL濃度逐漸升高，而3’-FL濃度逐漸降低；當pH值超過8.5時，3’-FL和2’-FL的轉化率均迅速下降。最終得到的mPbFuc29A1轉糖苷合成2’-FL相對最適條件為反應溫度35 ℃、反應pH 8.0、加酶量0.75 U/mL、反應時間4.0 h和乳糖濃度0.7 mol/L，相對最適條件下2’-FL的轉化率為23.6%，比野生型酶提高了9.1%，3’-FL的轉化率為56.4%，2’-FL和3’-FL的總轉化率為80%。

圖5 轉糖苷反應pH值（A）、加酶量（B）、反應時間（C）和乳糖濃度（D）對mPbFuc29A1合成2’-FL和3’-FL的影響Fig.5 Effects of pH (A), enzyme dosage (B), reaction time (C), and lactose concentration (D) on the synthesis of 3’-FL and 2’-FL by mPbFuc29A1

2.6 mPbFuc29A1序列分析、定點突變和結構模擬

測序結果表明，α-L-巖藻糖苷酶突變基因（mPbFuc29A1）中有2 個堿基發生改變，導致該突變體中2 個氨基酸發生改變，即Asp21Val和Glu266Lys，將PbFuc29A1和mPbFuc29A1的氨基酸序列與其他GH29家族α-L-巖藻糖苷酶進行序列比對，發現Asp21和Glu266均為部分保守氨基酸。

定點突變酶的轉糖苷產物分析結果表明（表3），與野生型α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1相比，突變體Asp21Val的轉糖苷產物比例沒有明顯變化，而突變體Glu266Lys的轉糖苷產物中3’-FL的比例明顯降低，2’-FL的比例明顯升高，推測第266位谷氨酸（Glu）突變是造成PbFuc29A1轉糖苷產物比例發生改變的關鍵因素。與突變體Glu266Lys相比，雙突變體Glu266Lys/Asp21Val的轉糖苷產物中2’-FL的比例有進一步提升。

表3 地桿菌α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1及其突變酶轉糖苷產物分析Table 3 Composition of the transglycosylation reaction products from PbFuc29A1 and its mutants

采用SWISS-MODEL對PbFuc29A1和mPbFuc29A1進行結構預測，結果如圖5所示。PbFuc29A1的單體結構由2 個結構域組成。N端結構域具有類似于（β/α）8-TIM桶的折疊，主要由6 個β-片層和10 個α-螺旋結構組成，其中催化殘基位于TIM桶內部。C端結構域則包括6 個反向平行的β-片層和1 個小的α-螺旋結構。在PbFuc29A1中，位于loop區第266位的谷氨酸（Glu）與第268位的賴氨酸（Lys）、第316位的絲氨酸（Ser）和第370位的絲氨酸（Ser）存在氫鍵相互作用，該位點在mPbFuc29A1中突變為賴氨酸（Lys266），與周圍的氨基酸氫鍵作用減弱（圖5B）。而第21位氨基酸在突變前后，與周圍氨基酸的氫鍵作用力無明顯變化（圖5C）。此外，通過預測PbFuc29A1（圖5B）和mPbFuc29A1（圖5C）的表面電荷分布，發現進化后的mPbFuc29A1催化凹槽左側區域的電性由弱負電變為強正，這主要是由Glu266Lys突變引起；而在催化凹槽背面的電性由強負變為中性，這主要是由Asp21Val突變引起。

圖5 α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1和mPbFuc29A1的結構和電荷分布Fig.5 Structures and charge distributions of PbFuc29A1 and its mutants PbFuc29A1-Asp21Val and PbFuc29A1-Glu266Lys

3 討 論

目前關于提高α-L-巖藻糖苷酶的轉糖苷活性及區域選擇性的研究多采用理性或半理性設計的方法[15,17]，定向進化技術應用較少[18]。本研究利用易錯PCR對地桿菌α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1進行隨機突變，從約10 000 個突變株中獲得了一個合成2’-FL能力顯著提高的突變酶mPbFuc29A1。

mPbFuc29A1的最適pH值為5.0，明顯低于一些細菌來源的α-L-巖藻糖苷酶，如解硫胺素芽孢桿菌（Paenibacillus thiaminolyticus，pH 7.0～9.0）[23]、產堿桿菌（Alcaligenessp.pH 7.0）[24]、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）BL23（pH 7.0）[25]和福賽斯坦納菌（Tannerella forsythia，pH 7.0）[26]等。但與大部分真菌來源的α-L-巖藻糖苷酶接近，如黑曲霉（Aspergillus niger，pH 5.0）[27]、禾谷鐮刀菌（pH 4.6）[14]和層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum，pH 5.5）[28]等。mPbFuc29A1的最適溫度為40 ℃，比PbFuc29A1提高了5 ℃，與大部分細菌和真菌來源的α-L-巖藻糖苷酶都接近，但明顯低于海棲熱袍菌[13]（60 ℃）和產堿桿菌[24]（50 ℃）來源的α-L-巖藻糖苷酶。值得注意的是，與PbFuc29A1相比，mPbFuc29A1的底物特異性發生顯著變化，對pNP-FUC和3’-FL的比活力顯著降低，但是對2’-FL的比活力升高到3 倍左右。一般來說，α-L-巖藻糖苷酶的底物特異性與其轉糖苷產物組成相關[14,25]。因此，mPbFuc29A1底物特異性的變化可能會導致其轉糖苷產物的變化。此外，mPbFuc29A1的Km值（0.39 mmol/L）小于PbFuc29A1（0.77 mmol/L），表明突變酶對pNP-FUC的親和力增強，但該酶對pNP-FUC的比活力卻沒有升高。

目前，已有一些具有轉糖苷活性的α-L-巖藻糖苷酶被用于2’-FL的合成。本研究中，mPbFuc29A1合成2’-FL的轉化率最高為23.6%，與PbFuc29A1比較提高了9.1%，高于芽孢桿菌（13%）[12]和禾谷鐮刀菌（14%）[14]來源α-L-巖藻糖苷酶，與α-L-巖藻糖苷酶突變體FgFCO1-D286H相當（23%）[15]，但是低于海棲熱袍菌α-L-巖藻糖苷酶（32.5%）[13]。mPbFuc29A1合成3’-FL的轉化率為56.4%，合成2’-FL和3’-FL的總轉化率為80%，在2’-FL的合成中具有潛在應用價值。

近年來，柔性loop區對糖苷水解酶催化活性的影響越來越引起廣泛關注[29]。GH29家族α-L-巖藻糖苷酶呈現典型口袋拓補結構，活性口袋內部的氨基酸配體是嚴格保守的，但位于催化口袋周圍的loop環會影響催化口袋的形狀[30]。結構數據顯示，至少2 條loop環會參與酶的催化過程，且loop區在酶與底物結合后會發生變化[31-32]。因此，對α-L-巖藻糖苷酶催化口袋附近loop環區的氨基酸進行改造也是當前研究熱點。研究發現，對一些糖苷水解酶的loop區進行分子改造可提高酶的轉糖苷活性，如克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi）轉唾液酸苷酶[32]和兩歧雙歧桿菌α-L-巖藻糖苷酶[17]等的改造。Loop區影響酶的轉糖苷活性的機制可能有3 種：1）使催化口袋形成封閉的拓補結構；2）在催化活性中心入口處形成疏水環境；3）阻塞通往催化活性位點的水通道[17]。本研究中，α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1位于loop環區第266位氨基酸由谷氨酸（Glu）突變為賴氨酸（Lys），是酶催化活性發生改變的關鍵，改變了該酶對pNP-FUC、3’-FL和2’-FL的比活力。同時，該酶合成2’-FL轉化率提高，合成3’-FL的轉化率降低，但總轉化率仍高達80%。這可能是由于Glu266Lys氨基酸位點的變化降低了loop區與周圍氨基酸的氫鍵作用力，改變了酶的催化口袋的形狀，進一步改變了該酶的最適溫度和底物特異性等酶學性質[18,29-32]，增強了該酶在轉糖苷反應中對α-1,2-糖苷鍵的區域選擇性，進一步提高了該酶合成2’-FL的效率。

4 結 論

利用定向進化技術成功將地桿菌α-L-巖藻糖苷酶（PbFuc29A1）進行改造，使其合成2’-FL的轉化率從14.5%提高到23.6%。mPbFuc29A1水解2’-FL的比活力提高到3 倍左右，但是對pNP-FUC和3’-FL的比活力明顯降低。mPbFuc29A1中有2 個氨基酸發生替換，分別是Asp21Val和Glu266Lys，其中位于loop區的Glu266Lys是導致mPbFuc29A1c底物特異性和轉糖苷產物發生改變的關鍵。mPbFuc29A1在合成2’-FL中具有潛在的工業應用價值。