基于高通量測序的窖泥原核微生物群落結構及其理化因子相關性分析

張明珠，吳學鳳，穆冬冬，許博陽，孫 偉，蔣俊樹，閆曉明，鄭 志，姜紹通，李興江,*

（1.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽文王釀酒股份有限公司，安徽 臨泉 236400；3.安徽省農業科學院，安徽 合肥 230001；4.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，因為其獨特的發酵工藝和風味而享譽全球[1-2]。我國白酒的釀造歷史悠久，以富含淀粉的糧谷類為主要原料，大曲、小曲或麩曲作為糖化發酵劑，采用固態（少數采用液態或半固態）進行發酵，經蒸餾、貯存和勾調而成[3-4]。安徽地區流行喝高度白酒（乙醇體積分數主要在42%～53%之間），口味以濃香型為主[5]。安徽地產白酒以古井、金種子、迎駕和文王為代表，均屬于濃香型白酒[6]。濃香型白酒的釀造過程是環境微生物、大曲微生物和窖泥微生物等復雜物質能量代謝的過程[7]，加入大曲的糧糟在窖池內糖化，依賴于窖池中各種微生物群落的功能和作用完成釀造過程[8]。因此，窖泥中的微生物種類、數量繁多且復雜[9-10]。窖泥經過長期、連續的生產，不斷形成其獨特優質的微生物群落，這些微生物菌群代謝產生多種風味物質，例如酯、酸和醇[11-12]，并最終形成對酒質的提高及穩定至關重要的優質老窖泥[13]，正所謂“千年老窖萬年糟，酒好全憑窖池老”[14]。

近年來，隨著微生物組學和高通量測序技術的發展，使窖泥中蘊含的厭氧微生物科學奧秘逐步得以剖析。研究發現，這些微生物之間及與環境因子的相互作用，形成了復雜的窖泥微生物生態系統[15]。但具體窖泥中的理化因子與哪些菌群存在怎樣的相互作用關系，仍鮮有研究報道。目前對安徽產地濃香型白酒方面的研究，對古井貢酒的研究較多，而對其他品牌的濃香型白酒，如文王貢酒的研究較少。本研究通過對安徽文王白酒窖泥的理化特性與其微生物之間的相關性進行研究分析，試圖揭示各種理化指標對窖泥微生物群落組成的影響，以期為進一步提高白酒風味品質提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自文王酒廠2、20 a和30 a窖齡窖池窖泥[16]。采樣方法：池底泥采用五點取樣法，從窖池池底4 個角和中心點取樣混合，作為池底窖泥（2 a窖池：BPM_2；20 a窖池：BPM_20；30 a窖池：BPM_30）。池壁窖泥是從窖池的上中下層取樣混合，作為池壁泥樣品（2 a窖池：WPM_2；20 a窖池：WPM_20；30 a窖池：WPM_30），每個樣品取3 份，所取樣品每份約400 g。

納氏試劑 上海源葉生物科技有限公司；酒石酸鈉鉀、氯化銨、氯化鈉、硫酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀、硫酸亞鐵銨、硫酸亞鐵（均為分析純） 中國醫藥集團上海化學試劑公司；鄰菲啰啉 天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；VARIAN AA240原子吸收光譜儀美國瓦里安中國有限公司；MiSeqPE300 美國Illumina公司；DNeasy PowerSoil DNA分離試劑盒美國Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將采集樣品置于無菌袋中充分混勻后分成2 份，分別置于4 ℃冰箱（測定理化指標）和-80 ℃冰箱（窖泥DNA的提取）。將新鮮的窖泥樣品平攤在瓷盤中，自然風干，風干后研磨成粉，通過60 目篩，保存在磨口瓶中。銨態氮在風干過程中易變化，需用新鮮的泥樣測定，同時測定水分，以換算為風干樣的含量。

1.3.2 基因組DNA的提取、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增和高通量測序

窖泥微生物總基因組DNA利用DNeasy PowerSoil DNA分離試劑盒進行提取，提取方法按照試劑公司提供的實驗操作指南進行。然后利用1%瓊脂糖電泳對提取的窖泥微生物DNA進行質量檢測，并保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

16S rDNA擴增子測序的引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）與806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），擴增為16S rRNA基因的V3-V4區。利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）純化PCR產物，并通過QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統（Promega，Madison，WI，USA）檢測定量PCR產物濃度，最后在Illumina MiSeq測序平臺對PCR產物序列進行雙端測序（2×300 bp；Illumina MiSeq PE300，San Diego，CA，USA），建庫與測序在上海美吉生物技術有限公司完成。

1.3.3 窖泥理化因子分析

水分含量測定：采用常壓干燥法[17]；pH值：參照Tao Yong等[18]的方法，將窖泥經水提取后，用pH計測定；銨態氮含量：采用紫外-可見光分光光度法測定[19]；有效磷、速效鉀、腐殖質、鈣含量：采用原子吸收光譜法，由安徽國科檢測科技有限公司測定。

1.4 數據處理

原始測序序列由Flash和Fastp軟件進行拼接和質控過濾。序列的檢驗標準：1）過濾reads尾部質量值20以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads。2）根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，最小overlap長度為10 bp。3）拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列。4）根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。使用Uchime軟件除去嵌合序列。使用Usearch（version 7.0，http://drive5.com/uparse/）將序列按照97%的相似性聚類，進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），提取代表序列，并獲得OTU表。細菌OTU代表序列與Silva（Release132，http://www.arb-silva.de）數據庫比對，進行分類學注釋，并計算Shannon指數、ACE指數、Chao指數及文庫覆蓋率。采用Circos-0.67-7（http://circos.ca/）分析窖泥與微生物菌群的關系，采用R（pheatmap包）分析窖泥環境因素變化與細菌群落的相關性[20-22]。采用Origin 2018 64Bit、SPSS 21和Cytoscape 3.5.1軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 窖池窖泥理化因子分析

2.1.1 不同年份窖池窖泥樣品中理化因子含量差異

從表1可以看出，BPM_20和WPM_20的水分含量（（44.68±0.60）%和（46.55±0.05）%）稍高于BPM_30、WPM_30和BPM_2、WPM_2，且差異顯著。BPM_30、WPM_30和BPM_2、WPM_2之間無顯著性差異。但一般認為成熟窖泥的水分含量介于40%～50%之間，并且其含量會直接影響窖泥的pH值、腐殖質、微生物區系及其生長狀況[23-24]。由此可見，窖泥樣品的水分含量均屬正常范圍。BPM_2、WPM_2、BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30的pH值均有顯著性差異（P＜0.05），其中池壁窖泥的pH值普遍低于池底窖泥，酸性更強，與任道群[25]和孟雅靜[26]等研究的池底泥pH值大于池壁泥pH值結果一致。并且不同年份窖池的窖泥之間pH值差距也較大，整體階段的pH值呈現出逐漸升高后又緩慢降低，最后趨于穩定（5.67±0.03和4.92±0.05）。廖昶等[27]發現適當的pH值不但能促進乙醇發酵，而且還有利于產香前體物質的形成，提高原酒質量。銨態氮是微生物自身繁殖、合成各種蛋白質以及酶類所必需的物質，適量的銨態氮對維持窖泥生境，提高酒質有著重要作用[28]。由表1發現，銨態氮含量與不同年份窖池窖泥pH值變化呈現出類似規律，池底窖泥的銨態氮含量普遍高于池壁窖泥，差異顯著（P＜0.05）。但BPM_20和BPM_30差異不顯著。此外，在對有效磷和速效鉀的分析中發現，BPM_2和WPM_2中有效磷的含量顯著低于BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30。BPM_20和WPM_20之間也存在著一定的差異。速效鉀的含量變化趨勢和窖泥中有效磷的含量變化趨勢基本一致，都呈現出逐漸上升，然后緩慢下降，最后趨于穩定的趨勢。并且不同階段窖池的各窖泥樣品之間都存在顯著性差異（P＜0.05）。這可能是因為有效磷是細菌與真菌分泌分解植酸酶作用后生成[29]，并且與有效磷含量與土壤中微生物生物量及代謝呈正相關[30]。窖泥中的速效鉀主要是指水溶性鉀，是微生物可以利用的鉀元素[31]，窖泥中適量速效鉀有利于窖泥微生物的生長繁殖。這也與窖泥樣品與菌群關系的結果一致，20 a和30 a窖泥樣品中微生物多樣性顯著高于2 a的窖泥樣品。窖泥的鈣含量與其他理化因子含量存在很大不同，BPM_2和WPM_2中鈣含量最高與其他窖泥樣品具有顯著性差異，在窖泥老熟過程中鈣含量逐漸降低并趨于穩定。這可能是因為新的發酵窖泥中鈣含量較高，隨著窖池的老熟，窖池窖泥中己酸菌得到富集，窖泥中的鈣不斷被利用最后達到動態平衡[28]。窖泥中腐殖質含量的變化沒有呈現出與不同年份之間的規律性，BPM_2和WPM_2的腐殖質含量差異顯著，但BPM_30和WPM_30中腐殖質含量無顯著性差異，含量趨于穩定值。劉梅等[32]也發現雖然在窖泥當中腐殖質需要達到一定質量分數，但是其與窖泥品質的變化并不存在規律性。

表1 不同年份窖池池底泥和池壁泥的理化性質Table 1 Physicochemical properties of bottom pit mud and wall pit mud from pits of different ages

窖泥質量的優劣對濃香型白酒的質量起著至關重要的作用，并且窖泥質量的優劣與窖池窖齡的相關性是一個動態變化的過程，首先新窖泥逐步老熟，形成優質窖泥，再從優質窖泥逐漸退化。先前的研究發現新窖泥和退化窖泥與優質窖泥相比，具有低含水量、低pH值和低有效磷的特征[26,33]，因此，可以通過窖泥的理化指標合理判斷窖泥的質量優劣。總體來看，20 a窖泥的水分含量、pH值、銨態氮、有效磷和速效鉀含量都顯著高于2 a窖泥（P＜0.05），但2 a窖泥中的鈣含量卻是20 a窖泥的2.17～2.32 倍，由此也可以合理推斷，窖泥在2～20 a是一個從新窖泥逐漸老熟到優質窖泥的過程，窖泥的水分含量、pH值、銨態氮、有效磷和速效鉀含量都與窖齡呈正相關，但窖泥的鈣含量則與窖齡呈負相關。王春艷等[34]比較分析了6 a和16 a窖泥的理化指標時發現，隨著窖齡的增加，窖泥的pH值、水分、銨態氮和有效磷等含量均呈現增長的趨勢，與本研究結果一致。而從20～30 a，窖泥開始退化，但退化的速度較為緩慢，因此僅有水分含量、pH值和銨態氮含量具有顯著性差異（P＜0.05），而其他理化指標均無顯著性差異（P＞0.05），此時窖泥的水分含量、pH值和銨態氮含量則與窖齡呈負相關，而其他的理化指標則無明顯相關性。綜合比較30 a窖泥和2 a窖泥發現，其pH值、銨態氮和有效磷含量均顯著高于2 a窖泥（P＜0.05），但其鈣含量僅為2 a窖泥的0.57～0.61 倍。

2.1.2 窖泥理化指標主成分分析（principal component analysis，PCA）

窖泥樣品理化指標提取到的PC1和PC2特征值分別是4.72和1.13，均大于1，累計方差貢獻率為83.43%，說明成分劃分合理。如圖1所示，按照PC1和PC2的劃分，水分含量、銨態氮和pH值、有效磷、速效鉀和腐殖質集中在同一區域，鈣含量單獨占據一區域。這些理化因子能夠為微生物提供營養物質和其生長代謝必不可少的元素，與微生物的生長密切相關。因此，在同一區域的理化因子含量變化的基本趨勢一致，僅有鈣含量與其他理化因子不同，這與之前對理化指標含量差異的分析結果一致。因此按照PC1和PC2劃分出的理化指標具有一定的科學性。

圖1 窖泥樣品理化指標PCA圖Fig.1 Principal component analysis plot of PC1 versus PC2 for physicochemical indexes

2.2 窖泥理化因子與窖泥菌群相關性研究

2.2.1 窖泥樣品原核微生物α多樣性指數與OTU數目比較分析

如表2所示，每個窖泥樣品序列數介于32 029～44 916 條，其中20 a和30 a窖泥的序列數量顯著高于2 a窖泥，但其在不同位置窖泥之間無顯著差異（P＞0.05）。從窖泥樣品物種豐富度（Sob指數、ACE指數和Chao指數）、多樣性（Shannon指數）、均勻度（Simpson指數）及覆蓋率可以看出，老窖泥當中的微生物群落更豐富，多樣性更高，這表明窖泥原核微生物群落的α多樣性存在顯著的時間異質性，并且在20～30 a這個過程當中，窖泥質量開始呈現退化趨勢。有研究發現Shannon指數與窖泥質量呈正相關，能很好地反映窖泥老熟和退化程度[10,35]，20 a窖泥的Shannon指數顯著高于2 a窖泥，30 a窖泥的微生物多樣性與其相比也有降低的趨勢，這也很好地反映了窖泥老熟和退化的過程。

表2 不同年份窖泥樣品原核微生物群落α多樣性指數Table 2 α-Diversity index of prokaryotic community in pit mud samples of different ages

如圖2a所示，BPM_20中的OTU數目最多，并且不同窖泥樣品中特有OTU及其總含量分別為28和9.52%（BPM_2）、26和14.20%（WPM_2）、28和21.15%（BPM_20）、30和19.13%（WPM_20）、5和15.23%（BPM_30）、23和20.76%（WPM_30）。2 a的30 a的窖泥樣品中，池壁窖泥的OTU數目均高于池底窖泥，但是在20 a窖泥當中，其池底窖泥的微生物多樣性更高，這表明在優質窖泥當中，池底窖泥的微生物種類更加豐富。并且由圖2b可知，池壁窖泥的OTU種類和數目均高于池底窖泥，并且其特有OTU含量也更高（113，14.66%），這主要來源于2 a和30 a池壁窖泥樣品較高的相對含量比，這也表明在新窖泥和即將退化的池壁窖泥當中存在一些影響窖泥質量的微生物菌群，而這些菌群具體是哪些，還需要進一步的分析研究。

圖2 不同窖泥樣品（a）和池壁窖泥和池底窖泥中OTU水平Venn圖（b）Fig.2 Venn diagram of OTUs in pit mud samples of different ages (a) and those in bottom vs.wall pit muds (b)

2.2.2 窖泥樣本與菌群組成關系分析

從圖3a可以看出，共有6 個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、互養菌門（Synergistetes）、放線菌門（Actinobacteria）、Patescibacteria和軟壁菌門（Tenericutes）。在2 a的窖泥樣品中僅發現1 個優勢菌門Firmicutes（BPM_2和WPM_2中平均相對豐度大于0.1%），在20 a和30 a的窖泥中發現4 個優勢菌門（Firmicutes、Bacteroidetes、Synergistetes、Actinobacteria；BPM_20、WPM_20和BPM_30、WPM_30中平均相對豐度大于0.1%）。同時發現Firmicutes在不同窖齡的窖泥當中含量存在很大差異，由高到低依次為Firmicutes（BPM_2，99.49%；WPM_2，99.75%）＞Firmicutes（BPM_30，77.30%；WPM_30，84.88%）＞Firmicutes（BPM_20，54.26%；WPM_20，65.67%）。Firmicutes的相對豐度在窖泥逐漸老熟到開始退化的過程中呈現出一種先降低后增加的趨勢，Tao Yong等[18]的研究也與本實驗結果一致。另外在屬水平上，共發現25 個菌屬（圖3b），其中在2 a的窖泥樣品中仍是僅有1 個優勢菌屬乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（BPM_2和WPM_2中平均豐度含量大于0.1%），并且2 a窖泥的Lactobacillus的相對豐度顯著高于20 a和30 a的老窖泥，因此可以看出Lactobacillus含量與窖泥質量呈一定負相關，而2 a窖泥中較低的pH值，也為Lactobacillus創造了更為有利的生長條件。分別在20 a和30 a的窖泥中發現15 個和17 個優勢菌屬（BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30中平均相對豐度大于0.1%）。由此可見，BPM_2和WPM_2中Lactobacillus占據絕對優勢地位，菌群種類單一，BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30中各種菌群分布均勻且種類豐富。由此可見，不同的窖泥樣品中微生物群落結構仍存在較大差異，胡曉龍[16]研究發現也證實了本實驗結果。

圖3 不同年份窖泥樣品與菌群關系門水平（a）和屬水平（b）Circos圖Fig.3 Circos diagram for microflora structure in pit mud samples of different years at phylum (a) and genus level (b)

2.2.3 窖泥理化因子與菌群的相關性分析

由圖4可知，水分含量、pH值、銨態氮含量與Lactobacillus呈極顯著負相關。并且pH值與瘤胃梭菌屬（Ruminiclostridium）、Fermentimonas和Caldicoprobacter等17 個菌屬呈顯著正相關（P＜0.05）。水分含量與Petrimonas、互養單胞菌屬（Syntrophomonas）和Sedimentibacter等11 個菌屬顯著正相關（P＜0.05）。銨態氮含量與Fermentimonas、Ruminiclostridium和Petrimonas等9 個菌屬顯著正相關（P＜0.05）。而腐殖質含量與Petrimonas、Syntrophomonas和Hydrogenispora等5 個菌屬呈顯著正相關（P＜0.05）。有效磷和速效鉀均與Anaerocella呈顯著性正相關，與其他少數菌屬呈顯著負相關（P＜0.05），因此有效磷和速效鉀聚集為一簇。鈣含量與其他理化指標不同，它僅與熱微菌屬（Tepidimicrobium）等4 個菌屬顯著正相關，與其他菌屬均無顯著相關，這也是其單獨聚為一簇的原因。這也與圖4中理化指標的PCA結果一致。另外根據圖4也可以直觀地看出pH值、水分含量和銨態氮分別與屬水平總豐度前30物種當中的18、12、10 個菌屬具有顯著相關性，因此這3 個環境因子對菌群的影響最大。劉梅等[32]也發現pH值和銨態氮對窖泥微生物群落的影響較大，銨態氮可以被窖泥微生物直接利用，其含量在一定程度上體現了窖泥對微生物生長代謝所需氮源的供給能力[36]，但是其含量并不是越多越好，窖泥當中不同的微生物菌群對養分的響應程度不同，因此酒廠需要合理的工藝方法調整營養物質的含量，平衡微生物的群落結構。弱酸性環境是窖泥微生物正常代謝繁殖的必要條件，在發酵過程中對產酸和產酯具有重要作用[37]，因此窖泥的pH值會顯著影響窖泥微生物自身的繁殖及其參與的生化反應。

圖4 窖泥理化因子與菌群相關性熱圖Fig.4 Heatmap of correlation between pit mud physicochemical indexes and microflora

從圖5可以看出，樣品理化指標中pH值、水分含量、銨態氮含量對微生物群落的影響較為相似，并且影響程度較大，其次是有效磷含量、腐殖質含量和鈣含量。在總豐度排名前5的物種中，發現瘤胃菌科（Ruminococcaceae），與30 a窖池的窖泥有很強的正相關。鞭毛科（Dysgonomonadaceae）、梭菌科（Clostridiaceae_1）和互養菌科（Synergistaceae）與20 a窖池的窖泥樣本有較高相關性，而乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）則主要存在于2 a窖池的窖泥樣本中。并且20 a和30 a的老窖泥樣本聚集在一簇，而2 a的新窖泥單獨聚集于一簇。與此同時，發現BPM_2和WPM_2樣本分布幾乎重合，而BPM_20、BPM_30和WPM_20、WPM_30分布范圍較廣，這也進一步說明老窖泥當中的微生物多樣性更高，新窖泥當中的微生物組成更為單一。對于Dysgonomonadaceae、Clostridiaceae_1和Synergistaceae，可以看出水分含量、pH值、銨態氮含量和腐殖質含量與其呈正相關；對于Ruminococcaceae，可以看出鈣含量與其呈正相關，而有效磷、速效鉀含量與其呈負相關。更為明顯的是水分含量、pH值、銨態氮含量和腐殖質含量均與Lactobacillaceae呈負相關。冗余分析（redundancy analysis，RDA）的實驗結果印證了理化指標中的水分含量、pH值、銨態氮含量對細菌存在較大的相關性，反映了不同年份窖泥樣品中細菌微生物群落的差異性。

圖5 窖泥理化指標和微生物群落冗余分析結果（科水平）Fig.5 Redundancy analysis of physicochemical indexes and microbial community in pit mud at family level

從圖6a可以看出，銨態氮、有效磷、速效鉀和鈣含量這4 項理化指標都僅與1 個微生物菌屬存在高度相關性（P＜0.01）。而水分含量與Lactobacillus呈高度負相關，與其他Aminobacterium、Sedimentibacter和Syntrophomonas等5 個屬的菌群均為高度正相關；pH值與Lactobacillus呈高度負相關，與其他Ruminiclostridium、Proteiniphilum和Caldicoprobacter等8 個屬的菌群呈高度正相關；腐殖質與Petrimonas和Syntrophomonas均呈高度正相關。由圖6b可知，共線性網絡共有12 個節點（2 對負相關，10 對正相關），其中pH值對50.00%的菌門都具有高度相關，水分含量和銨態氮含量對16.67%的菌門具有顯著相關，而速效鉀僅與1 個菌門具有高度相關。綜合來看，pH值對微生物菌群的影響最大，范圍最廣。Belenguer等[38]也發現乳酸和丁酸水平與pH值密切相關，土壤pH值降低往往會降低微生物整體多樣性并改變原核生物群落的組成。此外，窖泥中呈負相關的微生物主要發生在Lactobacillus屬和Firmicutes門，2 a窖泥中Lactobacillus屬產生大量乳酸，乳酸積累使窖泥的pH值下降，因此Lactobacillus和pH值可以作為衡量窖泥質量的重要指標。

圖6 窖泥理化指標和微生物菌群高度相關性分析屬水平（a）和門水平（b）共現性網絡圖Fig.6 Co-occurrence network diagram showing high correlation between pit mud physicochemical indexes and microbial flora at genus (a) and phylum (b) level

3 結 論

本研究通過分析2、20 a和30 a窖池池壁泥與池底泥的理化性質和原核菌群結構，發現：1）2 a窖池的窖泥均具有顯著的低pH值（4.28、3.99）、低有效磷（13.96、16.95 mg/kg）和高鈣含量（1.76、1.67 g/kg）的特征。2）20 a和30 a的老窖泥當中微生物群落更豐富，多樣性更高。在門水平上，老窖泥中發現6 個優勢菌門，而2 a窖泥中僅Firmicutes一個優勢菌門。在屬水平上，2 a窖泥中Lactobacillus屬占絕對的優勢低位，菌屬種類單一，20 a和30 a的老窖池中分別有15 個和17 個優勢菌屬，菌屬多樣性程度高。3）RDA發現新窖池的池壁窖泥與池底窖泥聚類較為集中，而老窖池當中的聚類較為分散，進一步說明了老窖泥原核菌群的豐度和多樣性要高于新窖泥。4）理化因子與菌群的相關性分析發現，pH值、水分含量和銨態氮分別與屬水平總豐度前30物種當中的18、12 個和10 個菌屬具有顯著相關性，通過RDA也發現水分含量（60.77%）和pH值（49.62%）對相關性的解釋度最高，具有極顯著貢獻（P＜0.01），銨態氮的解釋度為33.91%，具有顯著貢獻（P＜0.05），因此這3 個環境因子對菌群的影響最大。

綜上，本實驗系統地研究了部分不同品質窖泥主要理化指標的差異并進行PCA，結合窖泥原核微生物群落多樣性在窖泥老熟及退化過程中的變化趨勢，以及窖泥理化指標與微生物菌群的相關性分析，結果發現，隨著窖泥年份的增加，窖泥老熟，在長期的往復發酵過程中，微生物不斷富集，進化，并衍生出更多的種群。窖泥的理化因子和微生物多樣性指數均可以作為判斷窖泥優劣的重要標準，本研究借助微生物和理化因子之間的相關性分析，為窖池的養護機制及優質窖泥的制作提供一定了的理論支撐，可以作為生產和提高產品質量的數據參考。