橙皮素與鐵蛋白的共價相互作用及其對鐵蛋白理化性質的影響

陳盛楠，劉玉茜，劉夢肴，孫冀萱，楊 瑞*

（食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

鐵蛋白是一種廣泛存在于動物、植物和微生物中的鐵存儲蛋白[1]，是由24 個亞基對稱組成的一個球狀分子。其內徑為8 nm，外徑為12 nm[2]。鐵蛋白亞基圍繞形成12 個二重軸通道、8 個三重軸通道和6 個四重軸通道[3]，這些通道被認為是小分子物質進出鐵蛋白的媒介[4]。鐵蛋白能夠在其內部空腔存儲可溶的、無毒的、生物可利用的Fe3+并調控細胞內鐵代謝平衡，是開發補鐵制劑的良好原料[1]。因此鐵蛋白在食品、藥品、保健品方面具有廣泛的應用前景。然而，鐵蛋白在食品加工環境中（例如熱、氧、pH值）不夠穩定進而破壞其結構，從而影響蛋白質的應用。

利用食品天然組分（如多酚類物質）構建蛋白質-多酚復合物是提高蛋白質穩定性的良好途徑。蛋白質和多酚的結合包括共價[5]和非共價[6]2 種結合方式。非共價相互作用主要是指蛋白質和多酚以氫鍵、范德華力、疏水作用等方式結合[7-9]。蛋白質和多酚共價結合的方式主要包括酶促反應[10]和非酶促反應[11-12]。通常，共價相互作用相對于非共價相互作用表現出更強的作用力[13]。非酶促反應的共價相互作用一般發生在氧氣存在條件下的堿性溶液中，多酚被氧化成醌后，可與蛋白質側鏈上的氨基酸殘基（色氨酸、賴氨酸、半胱氨酸）生成穩定的化學鍵進而形成蛋白質-多酚共價復合物[14-15]。目前，麥醇溶蛋白、南瓜種子蛋白分離物已被報道可與多酚進行共價結合進而影響蛋白質的理化性質[16-17]。橙皮素（5,7,30-三羥基-40-甲氧基黃烷酮）是在柑橘類水果中常見的一種天然黃酮化合物。橙皮素是橙皮苷的糖基配體，其結構中含有酮羰基、醚基、甲氧基以及多個酚羥基，使其具有較為廣泛的藥理作用，例如抗氧化、抗癌、增強免疫力等[18]，被廣泛應用于食品、藥品、化妝品等多個領域。

本研究以鐵蛋白和橙皮素為材料，通過堿處理制備鐵蛋白-橙皮素共價復合物。采用熒光光譜研究不同濃度橙皮素與鐵蛋白的結合程度，并揭示復合物的結構變化；采用溶解度、Zeta電位、熱重、氧化沉淀和還原釋放等指標考察橙皮素對鐵蛋白理化性質的影響。這項研究將有助于改善鐵蛋白的理化性質，并且可在功能食品和制藥工業中拓展新的應用方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙皮素 美國Sigma-Aldrich公司；乙醇（分析純）天津市江天化工技術有限公司；過硫氨酸、甘氨酸、福林-酚 北京索萊寶生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇和考馬斯亮藍R250 中國國藥控股有限公司；電泳標記 美國GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TGL-16M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器有限公司；FG2 pH計 美國Mettler-Toledo公司；ZWJ-2102C恒溫培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；VE180電泳槽 天能電池集團股份有限公司；Zetaizer Nano ZS90激光粒度儀 英國馬爾文公司；Cary Eclipse熒光分光光度計、8453紫外分光光度計 美國安捷倫公司；UV 3600 Plus紫外-可見近紅外分光光度計 日本島津公司；TGA-Q50型熱重分析儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵蛋白的提取與純化

根據已報道的方法[19]，制備由大腸桿菌BL21菌株表達的重組大豆種子H-2亞基鐵蛋白（recombinant soybean seed H-2 subunit ferritin，rH-2），其與大豆種子鐵蛋白的H-2型亞基具有相似的氨基酸分布，制備的鐵蛋白內部空腔不含有鐵離子，是缺鐵的鐵蛋白。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

通過SDS-PAGE檢驗分離純化后的鐵蛋白純度和分子質量。電泳在15 mA恒流條件下進行，完成后使用考馬斯亮藍R-250進行染色。

1.3.3 鐵蛋白-橙皮素共價復合物的制備

按照已報道的方法制備橙皮素共價修飾的鐵蛋白[20]。將橙皮素（0.03 g）溶于體積分數70%的乙醇溶液（10 mL）中，并磁力攪拌25 min以制備儲備溶液。用NaOH（0.1 mol/L）溶液將鐵蛋白溶液的pH值調節至9.0。將橙皮素溶液稀釋并與4 組鐵蛋白樣品混合，使物質的量比為40∶1、80∶1、120∶1或160∶1（橙皮素/鐵蛋白）。上述4 種溶液中乙醇的最終體積分數分別為0.14%、0.28%、0.42%和0.56%。這些低體積分數的乙醇不會破壞鐵蛋白的穩定性。將這些混合物的pH值重新調節至9.0，然后用攪拌器在25 ℃充分混合24 h（暴露于空氣中）。將疊氮化鈉（0.2 g/L）添加到混合物中以防止微生物生長。最后將混合物用去離子水（pH 7.0）透析（截留分子質量為10 kDa）48 h，變化間隔為6 h，以確保未反應的游離橙皮素被完全透析出去。收集液體并命名為鐵蛋白-橙皮素共價復合物。由于鐵蛋白空腔中無鐵離子，在鐵蛋白-橙皮素共價復合物的形成及貯存過程中是沒有鐵離子參與的，避免了鐵離子的氧化作用對復合物的破壞。

1.3.4 熒光光譜分析

使用熒光分光光度計對鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價復合物（0.25 μmol/L，1.5 mL）進行熒光光譜分析。激發縫和發射縫分別為5 nm和10 nm。激發波長為290 nm，并且在300～500 nm的范圍內收集掃描發射光譜。

1.3.5 溶解性分析

利用1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉調節鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價復合物（0.5 μmol/L）的pH值（2～11），然后4 ℃、10 000 r/min離心15 min。取上清液采用考馬斯亮藍法[21]測定蛋白質的含量，以牛血清蛋白為標準物繪制標準曲線，鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素復合物的溶解度表示為上清液蛋白濃度占總蛋白濃度的百分比[22]。

1.3.6 Zeta電位分析

使用激光粒度儀分析樣品的Zeta電位。將鐵蛋白-橙皮素共價復合物、鐵蛋白（0.5 μmol/L）分別調節至不同pH值（4.0、5.0、5.5、6.0和7.0），在25 ℃條件下通過Zeta電位分析儀運行6 次。每個樣品進行3 次平行實驗，數據結果取平均值。

1.3.7 鐵蛋白的鐵氧化沉積分析

通過向缺鐵鐵蛋白體系（0.5 μmol/L）添加Fe2+（FeSO4，HCl酸性水溶解，pH 2.0），使最終Fe2+濃度為48 μmol/L，根據報道的方法分析鐵的氧化沉積性質[23]。使用紫外-可見近紅外分光光度計，通過記錄25 ℃條件下波長300 nm的吸光度進行測量。在90 s內記錄鐵的氧化動力學，根據報道的方法測量鐵的初始氧化速率[23]。

1.3.8 鐵蛋白的鐵還原釋放分析

通過向鐵蛋白樣品溶液（0.5 μmol/L，pH 7.0）中以20 min間隔逐漸加Fe2+（FeSO4，HCl酸性水溶解，pH 2.0），使最終Fe2+濃度為300 μmol/L，制備載鐵鐵蛋白。載鐵鐵蛋白釋放鐵的方法如下：每個反應體系（1 mL）包含0.5 μmol/L鐵蛋白-橙皮素共價復合物，500 μmol/L菲洛嗪（ferrozine）。通過加入抗壞血酸（1 mmol/L）引發鐵還原釋放反應。通過記錄波長562 nm處吸光度的增加測量[Fe(ferrozine)3]2+的形成，并按摩爾吸光系數ε562為27.9 L/（mmol?cm）測量鐵的釋放[24]，并計算鐵釋放的初始速率（v0）。

1.3.9 熱重分析

使用熱重分析技術對鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價復合物進行熱分析。將凍干的粉末狀樣品（3.5 mg）放入鋁鍋中稱質量，然后放入熱重分析儀中。空鋁鍋為對照。實驗過程中，氮氣以10 ℃/min的升溫速率在50～600 ℃的溫度下，對不同樣品進行熱重測量。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 鐵蛋白的制備

本研究使用重組大豆rH-2鐵蛋白作為鐵蛋白原料，它與天然H-2型大豆種子鐵蛋白的氨基酸序列高度相似，且更易于獲取[19]。將純化后的鐵蛋白通過SDS-PAGE確定其亞基分子質量，SDS-PAGE結果顯示它由一個分子質量28.0 kDa的亞基組成（圖1），與文獻[25]報道一致。因此，純化后的鐵蛋白符合實驗要求。

圖1 鐵蛋白純化后的電泳圖Fig.1 SDS-PAGE profile of purified ferritin

2.2 鐵蛋白-橙皮素共價復合物的熒光分析

每個鐵蛋白亞基的E螺旋上都有1 個色氨酸殘基[3]，可用于分析鐵蛋白的熒光變化。與對照鐵蛋白相比，熒光光譜中所有共價復合物的強度均顯著降低（圖2），這表明橙皮素的結合影響鐵蛋白的結構。隨著橙皮素含量的增加（物質的量比40∶1～160∶1），形成的共價復合物的熒光強度逐漸降低。隨著反應體系中橙皮素含量增加（物質的量比80∶1～160∶1），響應值的變化并不顯著。因此橙皮素與鐵蛋白的反應在80∶1比例可能達到飽和。另外，鐵蛋白-橙皮素共價復合物（物質的量比40∶1）的熒光光譜相對對照鐵蛋白紅移了約6 nm，鐵蛋白-橙皮素共價復合物（物質的量比80∶1～160∶1）的發射光譜相對于對照鐵蛋白紅移了約10 nm。該現象表明共價結合可能導致更多的鐵蛋白側鏈暴露于溶液中[26]，這會使色氨酸移至更親水的環境，因此通過橙皮素的共價修飾，鐵蛋白-橙皮素共價復合物的結構發生了改變。本研究選用80∶1比例（橙皮素/鐵蛋白）的鐵蛋白-橙皮素復合產物進行后續實驗研究。

圖2 鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價復合物的熒光光譜分析Fig.2 Fluorescence spectra of ferritin and its complexes with hesperetin at different molar ratios

2.3 溶解度分析

如圖3所示，在pH 2～6范圍內，鐵蛋白-橙皮素共價復合物與對照鐵蛋白相比會有相對較低的水溶性（P＜0.05），在pH 7～11范圍內，鐵蛋白-橙皮素共價復合物的溶解度提高并且與對照蛋白相比差異不顯著（P＞0.05）。該發現與Rawel等[27]報道類似，其發現乳清蛋白和槲皮素共價結合后，復合物的溶解度降低。不同的是，Wei Zihao等[13]提出乳蛋白和-表沒食子兒茶素沒食子酸酯共價結合會提高乳蛋白的水溶性。因此，推斷小分子化合物的溶解性可能影響其結合后形成的復合物的溶解性。本研究中，疏水性橙皮素的結合在不同pH值范圍內表現出不同的作用，在pH 7～11范圍內，鐵蛋白-橙皮素共價復合物的溶解度表現與對照蛋白類似。因植物鐵蛋白本身溶解性良好，復合物溶解度的維持可為其在水性食品形式（如飲料）中的應用提供理論基礎。

圖3 鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價復合物的溶解度Fig.3 Solubility of ferritin and hesperetin-ferritin complex at a molar ratio of 80:1

2.4 Zeta電位分析

如圖4所示，鐵蛋白溶液的Zeta電位在低pH值時（＜5.25）表現為帶正電荷，高pH值時（＞5.25）表現為帶負電荷，零電荷點出現在pH 5.25左右。不同的是，橙皮素共價結合后鐵蛋白-橙皮素共價復合物的Zeta電位變化明顯。零電荷點出現在pH 4.8左右。此結果證明了橙皮素的結合可以顯著降低鐵蛋白的等電點。復合物等電點的降低有利于擴展其在酸性食品和飲料中的應用。

圖4 鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價復合物的Zeta電位Fig.4 Zeta potentials of ferritin and hesperetin-ferritin complex

2.5 鐵的氧化沉淀分析

鐵蛋白的氧化沉淀活性是指鐵蛋白利用其氧化位點可將Fe2+在氧存在條件下氧化成Fe3+的過程，生成的Fe3+可以被運輸并貯藏于鐵蛋白的空腔結構中。本研究利用波長300 nm處的紫外吸收監測鐵蛋白鐵氧化沉淀過程中Fe3+的形成[28]。實驗選用96 Fe2+/鐵蛋白體系，結果發現對照鐵蛋白最初以22.50 μmol/s的速率催化Fe2+的氧化（圖5）。不同的是，鐵蛋白-橙皮素共價復合物的Fe2+氧化初始速率為32.36 μmol/s，顯著高于對照組（P＜0.05）。因此，橙皮素在鐵蛋白上的結合促進了鐵蛋白的鐵氧化沉淀活性。鐵蛋白的鐵氧化位點通常位于其親水性3 倍軸通道上，該通道被認為是鐵離子通過蛋白質外殼進入內部的途徑[29]，橙皮素的結合可能影響了鐵蛋白3 倍軸通道的結構，進而一定程度上促進了鐵離子的氧化。在鐵離子的代謝過程中，機體過量的Fe2+水平會產生毒副作用，表現為其能夠誘發產生很強氧化能力的羥自由基，易造成細胞損傷甚至死亡。橙皮素對鐵蛋白的共價修飾作用促進了鐵離子的氧化，該作用可能會對減輕鐵離子的毒副作用具有重要意義。

圖5 鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價復合物進行Fe2＋氧化的時間過程Fig.5 Time course of ferrous iron oxidation with ferritin or hesperetinferritin complex

2.6 鐵的還原釋放分析

鐵蛋白的還原釋放是指鐵蛋白在還原劑存在的情況下，將貯藏于鐵蛋白內部空腔內的Fe3+還原為Fe2+，隨后將Fe2+釋放于外部環境當中。實驗選用600 Fe2+/鐵蛋白體系，鐵蛋白釋放出來的Fe2+與螯合劑ferrozine可以形成螯合物[Fe(ferrozine)3]2+，該螯合物在波長562 nm條件下有很強的吸光度，因此可以用于檢測還原釋放過程。與氧化沉積途徑不同，植物鐵蛋白的4 倍軸通道通常可作為植物鐵蛋白鐵釋放的途徑[30]。結果顯示鐵蛋白-橙皮素共價復合物的Fe2+釋放初始速率為4.31 nmol/s，顯著低于鐵蛋白的5.52 nmol/s（P＜0.05）（圖6）。因此，橙皮素的結合顯著降低了鐵蛋白的鐵還原釋放能力。其可能是由于橙皮素結合在鐵蛋白外表面引起鐵蛋白結構變化導致的。

圖6 1 mmol/L抗壞血酸誘導鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價復合物釋放Fe2＋的動力學Fig.6 Kinetics of Fe2＋ release from ferritin and hesperetin-ferritin complex induced by 1 mmol/L ascorbic acid

2.7 熱重分析

蛋白質分解分為3 個階段，第1階段為水分蒸發階段，這一階段質量損失較少，且漸漸趨于平穩；第2階段為質量快速分解階段，大部分的蛋白質在此階段經高溫快速分解，此階段質量損失較快；第3階段為質量緩慢損失階段[31]。由圖7A可知，對照鐵蛋白的起始質量損失溫度為254 ℃，鐵蛋白-橙皮素共價復合物的起始質量損失溫度為263 ℃，鐵蛋白-橙皮素共價復合物較鐵蛋白的起始質量損失溫度增加了9 ℃，由此推斷鐵蛋白-橙皮素共價復合物的熱穩定性具有一定程度的增強[17]。

圖7 鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價復合物的熱重（A）和紫外吸收熱變性曲線（B）Fig.7 TGA profiles (A) and UV denaturation curves (B) of ferritin and hesperetin-ferritin complex

為了驗證該結論，比較40～90 ℃范圍內鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價復合物的紫外熱變性曲線（圖7B），研究發現，鐵蛋白-橙皮素共價復合物的轉變溫度為77.8 ℃，顯著高于鐵蛋白的轉變溫度（73.2 ℃）（P＜0.05）。推斷鐵蛋白和橙皮素的共價修飾影響了鐵蛋白的空間結構，從而增強了鐵蛋白的熱穩定性。熱加工通常是食品生產的重要步驟，但是加熱處理可能會破壞蛋白質的結構和性質，鐵蛋白-橙皮素復合物的形成增強了鐵蛋白的熱穩定性，在一定程度上可以提高鐵蛋白在加工過程中的對熱耐受性。復合物的熱穩定性的增強也有助于其作為包封食品營養小分子的納米載體在涉及熱處理食品中的應用。

3 結 論

本研究通過堿處理方法制備鐵蛋白-橙皮素共價復合物。橙皮素與鐵蛋白相互作用影響了鐵蛋白的結構，并且復合物在不同pH值條件下的溶解度發生了一定程度的改變，其等電點明顯降低。另外，橙皮素的結合提高了鐵蛋白中鐵離子的氧化沉積速率，降低了鐵蛋白中鐵離子的還原釋放速率。同時，橙皮素的共價結合改善了鐵蛋白的穩定性。該研究為探索典型食品成分（蛋白質和活性組分）的相互作用提供一定理論指導，也為提高蛋白質的穩定性提供一種新途徑。鐵蛋白作為一種納米結構蛋白質，橙皮素的結合為其作為活性成分的傳遞載體賦予了新的功能特性，這一發現將為鐵蛋白在今后食品加工中的應用提供一定的指導和借鑒。