奧貝膽酸關鍵中間體雜質的設計與合成

魏 霞, 文小清, 母慧聰, 黃晴菲, 張 燕*, 王啟衛1,*

(1.中國科學院 成都有機化學研究所，四川 成都 610041；2.中國科學院大學，北京 100049；3.西華大學 理學院，四川 成都 610039)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD)已成為全球第一大慢性肝臟疾病[1-6]。奧貝膽酸(商標為Ocaliva)是一流的法尼類X受體(FXR)激動劑，用于治療原發性膽汁肝硬化非酒精性脂肪性肝病的有效藥物，其市場價值巨大[7-9]。

化學藥物的雜質是指存在于原料藥中，但化學結構與原料藥不同的任何一種成分。藥品質量的高低與人們的生命健康安全有著密切的關系。因此雜質合成研究在藥物質量研究控制中占有重要地位，需對原料藥進行全面的雜質譜研究和控制[10-15]。

本文以易得的3-α-乙酰基-6-β-乙烯基-7-酮石膽酸甲酯為原料，先氫化制得中間體3-α-乙酰基-6-β-乙基-7-酮石膽酸甲酯(6)[16]；在堿性條件下脫保護，同時6位乙基發生構型翻轉得到中間體6-α-乙基-7-酮石膽酸(7)；如6-位不發生翻轉，產生中間體7的非對映異構體雜質6-β-乙基-7-酮石膽酸(A)；水解脫除保護基時，通過控制堿的濃度就可獲得具有不同構型的6-位取代的化合物A和化合物7；再由化合物A和化合物7，經酯化或者乙酰化，就可得到雜質B、雜質C、雜質D或雜質E(Scheme 1)。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance-300 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標)；Bruker LC-QTOF型高分辨質譜儀；Waters 515 型高效液相色譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)6-β-乙基-7-酮石膽酸(A)的合成

稱取中間體625.00 g(0.053 mol)，溶解于290 mL混合溶液(四氫呋喃/甲醇=1/1,V/V)中，完全溶解后，加入1 M NaOH水溶液100 mL，室溫下反應2.5 h(TLC檢測)。反應完全后蒸干溶劑，殘余物加二氯甲烷溶解，再滴加1 mol/L HCl溶液調節pH為3，用水(3×200 mL)洗滌，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V)純化得白色固體A17.8 g，收率81%，HPLC純度98.7%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 3.47(m, 1H), 2.47(t,J=11.3 Hz, 1H), 2.27(m, 1H), 2.20～1.99(m, 2H), 1.96～1.81(m, 3H), 1.81～1.50(m, 7H), 1.37(m,J=9.0 Hz, 5.4 Hz, 4H), 1.25(m, 2H), 1.18～0.98(m, 7H), 0.86(d,J=6.3 Hz, 3H), 0.81～0.68(m, 3H), 0.60(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 215.40, 176.55, 70.15, 61.98, 54.69, 49.46, 48.55, 45.42, 42.70, 42.34, 39.84, 38.65, 35.67～34.74, 30.88, 29.32, 28.02, 26.43, 25.82, 24.77, 21.25, 18.21, 12.93, 11.94; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C26H42O4Na {[M+Na]+}441.2975, found 441.2964。

(2)6-β-乙基-7-酮-石膽酸甲酯(B)的合成

稱取A5.00 g(0.012 mmol)溶解于140 mL 甲醇中，完全溶解后，緩慢滴加3 mL濃硫酸至反應液,室溫下反應1 h(TLC檢測)。反應完全后蒸干溶劑，殘余物加二氯甲烷溶解，用水(3×200 mL)洗滌，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)純化得白色泡沫狀固體B2.96 g，收率57%，HPLC純度99.6%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 3.65(s, 3H), 3.55(s, 1H), 2.55(t,J=11.3 Hz, 1H), 2.35(m, 1H), 2.27～2.06(m, 1H), 2.04～1.85(m, 3H), 1.70(m, 8H), 1.54～1.23(m, 4H), 1.23～1.02(m, 4H), 0.91(d,J=6.2 Hz, 3H), 0.83(m, 3H), 0.66(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 215.46, 174.68, 70.62, 62.08, 54.78, 51.47, 49.59, 48.68, 45.56, 42.89, 42.50, 39.82, 38.79, 35.58, 35.34, 35.22, 31.03, 30.97, 29.55, 28.17, 26.59, 25.95, 24.90, 21.42, 18.33, 13.06, 12.08; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C27H44O4Na {[M+Na]+}455.3132, found 455.3118。

(3)3-α-乙酰基-6-β-乙基-7-酮石膽酸(C)的合成

依次稱取A5.00 g(0.012 mol)，NaHCO320.00 g(0.238 mol)，乙酸酐20 mL(0.210 mol)溶解于200 mL 四氫呋喃中，65 ℃下回流攪拌12 h(TLC檢測)。反應完全后蒸干溶劑，殘余物加二氯甲烷溶解，再滴加1 mol/L HCl溶液調節pH為5，用水(3×200 mL)洗滌，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)純化得白色固體C1.82 g，收率33%，HPLC純度98.3%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 6.11(s, 2H), 4.65(m, 1H), 2.56(t,J=11.3 Hz, 1H), 2.47～2.07(m, 3H), 2.06～1.87(m, 6H), 1.86～1.56(m, 7H), 1.56～1.02(m, 14H), 0.92(d,J=6.1 Hz, 4H), 0.84(q,J=6.2 Hz, 3H), 0.67(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 215.30, 179.87, 170.67, 72.80, 61.85, 54.82, 49.22, 48.65, 45.53, 42.93, 42.49, 38.77, 35.59, 35.24, 34.94, 31.32, 30.88, 29.68, 28.16, 26.50, 25.90, 25.72, 24.88, 21.46, 21.30, 18.34, 13.03, 12.10; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C28H44O5Na {[M+Na]+}483.3081, found 483.3070。

(4)6-α-乙基-7-酮-石膽酸甲酯(D)的合成

稱取中間體75.00 g(0.012 mmol)溶解于140 mL甲醇中，完全溶解后，緩慢滴加3 mL濃硫酸至反應液,室溫下反應1 h(TLC檢測)。反應完全后蒸干溶劑，殘余物加二氯甲烷溶解，用水(3×200 mL)洗滌，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)純化得白色泡沫狀固體D2.95 g，收率33%，HPLC純度96.0%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 3.67～3.63(m, 3H), 3.52(m, 1H), 2.68(m, 1H), 2.41～2.27(m, 2H), 2.26～2.10(m, 2H), 2.01～1.87(m, 2H), 1.86～1.58(m, 10H), 1.51～1.27(m, 6H), 1.20(s, 6H), 1.17～1.04(m, 4H), 0.89(m, 5H), 0.80(m, 4H), 0.64(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ:212.72, 174.66, 71.15, 54.76, 51.98, 51.45, 50.66, 49.91, 48.96, 43.67, 42.63, 38.97, 35.66, 35.18, 34.24, 31.78, 31.02, 30.97, 29.85, 28.26, 24.59, 23.48, 21.84, 18.80, 18.33, 12.03, 11.95; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C27H44O4Na {[M+Na]+}455.3132, found 455.3145。

(5)3-α-乙酰基-6-α-乙基-7-酮-石膽酸(E)的合成

依次稱取中間體7100 mg(0.239 mol), NaHCO30.4 g(0.005 mol)，乙酸酐0.4 mL(0.004 mol)，溶解于4 mL 四氫呋喃中，65 ℃下回流攪拌12 h(TLC檢測)。反應完全后蒸干溶劑，殘余物加二氯甲烷溶解，再滴加1 mol/L HCl溶液調節pH為5，用水(3×200 mL)洗滌，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)純化得白色固體E34 mg，收率31%，HPLC純度98.6%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 8.51(s, 1H), 4.60(m, 1H), 2.67(q,J=6.3 Hz, 1H), 2.33(t,J=11.1 Hz, 2H), 2.17(m, 2H), 1.96(s, 5H), 1.89～1.55(m, 8H), 1.55～1.00(m, 16H), 0.98～0.70(m, 9H), 0.62(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 212.58, 180.00, 170.60, 73.18, 54.72, 51.90, 50.41, 49.82, 48.84, 43.58, 42.54, 38.84, 35.58, 35.10, 33.77, 31.26, 30.79, 28.17, 27.63, 25.87, 24.48, 23.39, 21.78, 21.23, 18.72, 18.25, 11.98, 11.93; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C28H44O5Na {[M+Na]+}483.3081, found 483.3073。

2 結果與討論

2.1 構型的確定

為了確定6-乙基立體構型，對雜質A(圖1)和中間體7(圖2)的1H NMR進行了解析，兩個化合物8-H的化學位移由于受到化合物的立體結構的影響，分別為δ2.47的三重峰以及δ2.68的四重峰。通過比較兩個化合物的立體結構，中間體7的α型的乙基與羰基氧離得更近，易與羰基形成氫鍵，使8-H的化學位移向低場偏移。同時成功得到雜質A的單晶結構，進一步確定了化合物結構(圖3)，通過晶體結構可以看出，其6-乙基(C12和C13)為β構型。得到的5個雜質用HPLC進行含量測定，并且在該HPLC條件下，5個雜質能有效分離。

δ

δ

圖3 A的單晶衍射圖譜

2.2 堿的影響

實驗過程中，發現通過控制堿的濃度可獲得具有不同構型的6-取代的化合物，在使用10 M 氫氧化鈉時，可以以100%的收率得到單一化合物7；在1 M NaOH 的條件下，可以獲得兩種構型的6-取代的化合物(A/7=89/11)。

以易得的化合物5為原料，經過簡單的操作，合成了5個奧貝膽酸關鍵中間體雜質。并通過HPLC確定了所有雜質純度均在96%以上，為奧貝膽酸生產工藝的研究和質量研究提供了更簡單的雜質制備策略。