P450酶催化C—H鍵官能團化的研究進展

李應娜，萬南微，陳永正*

(1.遵義醫科大學 a.藥學院；b.貴州省生物催化與手性藥物合成重點實驗室；c.貴州省綠色制藥工程研究中心，貴州 遵義 563000)

C—H鍵選擇性活化是構建C—X鍵的有效策略[1-3]，該策略已成為向有機化合物中引入新功能基團最直接的方法之一[4]。在有機化合物中常常存在化學性質相似的C—H鍵[5]，且C—H鍵的解離能較高、極性小[6]，如何在溫和條件下實現C—H鍵的選擇性官能團化是該策略的研究難點。在傳統的合成化學中，金屬催化法[7-10]和有機小分子催化法[11]都是C—H鍵選擇性活化官能團化的重要路線，但該過程中涉及昂貴催化劑的使用，反應條件苛刻，存在化學、區域和立體選擇性控制難等問題。隨著生物信息學、分子生物學和結構生物學的發展，可通過定向進化技術賦予酶更多的催化功能，以P450單加氧酶為代表的生物催化方法在C—H鍵活化上取得了突破性的進展[12-15]。本文綜述了近10年P450酶催化C—H鍵選擇性官能團化方面的研究進展。

P450酶，全稱細胞色素P450(cytochrome P450或CYP450)，因血紅素還原態與一氧化碳結合后在450 nm有特征吸收峰而得名[16-17]。P450是一類硫醇鹽蛋白的超家族酶類，亞鐵血紅素近端連接到保守的半胱氨酸(Cys)殘基上，遠端則與反應底物相結合進行催化活化[18]。其廣泛存在于自然界的動植物、微生物體內，是一類擁有多種催化功能的酶，可以實現不同底物的羥基化、氨基化等。除此之外，P450酶還影響植物中天然產物的活性，參與類固醇、萜烯類、維生素等復雜天然產物的合成，參與動物的新陳代謝以及人體內藥物的分解代謝[19]。根據氨基酸序列的同源程度，其成員又依次分為家族和亞家族。根據自身能否實現亞鐵血紅素的輔酶循環又可將其分為自給型和非自給型。

醇類化合物是藥物、農藥、聚合物和天然化合物的結構單元，是多功能合成的中間體[20]。合成醇類化合物最直接有效的方法是C—H鍵直接氧化羥基化(直接將C—H鍵一步轉化為C—O鍵)[4]，符合綠色化學提倡的原子經濟性。目前，已有許多文獻報道，將P450酶作為催化劑實現C—H鍵的羥基化[21-24]。

早在1995年，Dawson等[25]就報道將P450cam作為催化劑，催化樟腦1實現C—H鍵的羥基化生成樟腦醇2，但這一過程中該酶展現出底物普適性和兼容性差等局限。P450cam能高選擇性氧化(1R)-樟腦生成(1R)-5-羥基-樟腦作為唯一產物；當底物換成(1S)-樟腦時，除了生成主要產物(1S)-5-羥基-樟腦外，還會有少量的2,5-雙酮產物產生(Scheme 1)。

Scheme 1

自二十世紀九十年代以來，定向進化已成為改善菌株催化活性和選擇性的有效方法。2014年，李智等[26]報道了源自SphingomonasSp.HXN-200的P450pyr，是一種具有烷烴末端羥化功能的P450酶。通過迭代飽和突變(ISM)策略對P450pyr進行定向進化，成功得到了對烷烴次末端具有高區域選擇性和高立體選擇性羥化的P450pyr突變體，可用于催化烷烴C—H鍵的活化羥基化以制備高光學純的醇(Scheme 2)。2015年，李智等[27]又對P450pyr進一步定向進化獲得新的突變菌株，不僅提高了P450pyr對脂環族化合物的化學、區域和立體選擇性，而且使P450pyr對新的底物產生兼容性，完成了N-取代吡咯烷羥基化產物的構型互補、烷烴羥基化位點的改變以及催化正丁醇生成1,2-二丁醇，區域選擇性均高于98%，實現烷烴C—H鍵的區域/立體選性功能化(表1)。

表1 P450pyr及突變體的底物譜考察

與此同時，Priska等[28]采用迭代飽和突變策略對P450BM3進行了分子改造，得到了兩株對底物7具有高選擇性的突變體。其中F87A/I263L突變體對底物7的C9具有非常高的區域羥化活性(100%)；而L75A/V78A/F87G突變體則對底物7的C10具有較高的區域選擇性(97%)(Scheme 3)。

Scheme 2

Scheme 3

P450酶在催化過程中表現出高立體/區域選擇性，促使化學家們考慮用酶催化來補充甚至替代傳統的合成路線，用于實現藥物分子的修飾及合成。2009年，Fasan等[29]利用P450酶作為催化劑實現C—H鍵的羥基化，并將P450酶與化學法級聯實現含氟化合物的合成。這一過程主要是通過使用P450單加氧酶將羥基引入到目標骨架中，再使用親核氟化劑(DF)取代羥基實現氟化(Scheme 4)。使用具有不同區域選擇性的P450突變體與親核氟化劑(DF)級聯可獲得不同氟化衍生物。

Scheme 4

Scheme 5

Scheme 6

Scheme 7

Reetz等[21]利用突變景觀和分子動力學模擬合理設計迭代飽和突變，得到的突變體在兼顧活性的同時還可以實現類固醇C16的選擇性羥基化(Scheme 5)，其產物是糖皮質激素的組成部分，具有實用價值。

Fasan等[30]報道了利用P450酶調控天然產物青蒿素的不同位點的不對稱羥基化，通過定向進化提高該酶的區域和立體選擇性。以P450BM3突變體FL#62為該實驗的模板菌株，通過定向進化并結合高通量P450酶的指紋識別篩選方法得到3株突變體IV-H4、II-H10和X-E12，對青蒿素實現高區域和立體選擇性羥基化。模板菌株FL#62在該反應中選擇性差，生成產物中有83%的C7(S)，10%的C7(R)，7%的C6a；而突變體IV-H4可催化青蒿素只轉化為17；II-H10催化青蒿素只轉化為18；X-E12催化該反應選擇性生成的產物19比親本高87%(Scheme 6)。

Scheme 8

Scheme 9

Scheme 10

2014年，Fasan等[31]將P450突變體用于單萜內酯環(C9和C14)的高區域選擇羥基化(Scheme 7)。在羥基化產物的基礎上，通過化學法進一步合成一組新的小白菊內酯類似物，并且其中一些化合物具有抗原發性急性髓系白血病的能力。

2021年，Fasan等[32]利用高通量篩選方法篩選出P450突變體V-F10和V-H10，對具有抗白血病活性的天然產物(MCL)的C2和C14進行高選擇性羥基化，生成產物26和27(Scheme 8)，彌補了該類天然產物這兩個位點C—H鍵羥基化的空白，再進一步采用化學法對該兩個位點的羥基進行官能團化修飾，可顯著提升該藥物分子的抗白血病活性。

Scheme 11

Scheme 12

Scheme 13

Scheme 14

除了定向進化外，也有新的方法被開發用于彌補P450酶在催化羥基化過程中的不足，如構建級聯催化體系、光酶催化體系和引入誘導/輔助小分子等。2019年，陳永正等[33]利用P450酶與鹵醇脫鹵酶級聯反應，將鹵代烷烴化合物28高選擇性轉化為R構型的鹵代醇29，其ee值可以達到98%～99%(Scheme 9)。

為了擺脫P450酶對輔酶NADPH復雜循環系統的依賴，Reetz等[34]報道了第一個使用光驅動P450酶實現C—H鍵的羥基化，該反應使用可溶性的去氮黃素(deazaflavin)介質代替昂貴的NADPH輔因子作為廉價的電子供體。2019年，叢志奇等[35]利用直接干預策略和分子工程技術結合，創造出一種由細胞色素P450BM3突變體與輔助雙功能小分子DFSM組成的人工P450過氧酶系統，DFSM(一端含有可高效利用H2O2的咪唑，另一端含有可與P450BM3結合的酰基氨基酸碎片)在該系統中作為一種酸堿幫助催化劑激活H2O2(Scheme 10)，實現小分子烷烴的選擇性羥基化。

含氮化合物作為生物相關化合物、藥物和天然產物中關鍵的基礎結構，因此降低成本將化學原料轉化為高價值的手性胺是非常有吸引力的策略。在眾多的合成方法中，C—H鍵直接胺化因不需任何預官能團化而具有吸引力。酶因廉價、環保和催化選擇性高而成為一種“明星”催化劑，并且Arnold等已證明，P450酶可以在實驗室中被設計成為具有高催化效率和立體選擇性的催化劑從而實現C—H鍵胺化。

早在1985年，Breslow等[36]從肝微粒中提取了P450酶，并用于催化C—H鍵的氨基化，該報道證實了P450酶可用于催化C—H鍵胺化。直到2013年，Arnold等[37]利用定向進化技術得到P450BM3的突變體P411BM3(C404S)，將其用于催化底物31轉化為產物32(Scheme 11)，再次證明P450酶具有催化C—H鍵氨基化的能力。Fasan等[38]以2,4,6-三取代苯磺酰33a～35a為底物考察了P450BM3及其不同突變體在催化分子內C—H鍵氨基化反應的能力(Scheme 12)。實驗數據表明，不同突變體催化磺酸疊氮分子實現分子內氨基化的能力不同(表2)。

表2 不同P450突變體C-H鍵氨基化能力考察結果

隨后，Arnold等[39]又對P411BM3進一步改造得到兩株突變體P411BM3-Variant A/-Variant B，可以對磺酸疊氮分子36進行選擇性氨基化，并可選擇性生成相應的五元環產物37和六元環產物38(Scheme 13)。除此之外，Arnold等[40]對P411為模板菌株進行分子改造，還得到一系列突變體(P411Diane)可催化伯、仲和叔C(sp3)—H鍵的對映選擇性胺化，展現出優良的底物譜適性(Scheme 14)。

除了P450BM3外，Hartwig等[41]報道了一種源于嗜熱生物中的P450酶(Ir(Me)-PIX)，該P450酶含有銥卟啉環。Ir(Me)-PIX可以催化不同取代基磺酸疊氮化合物46的分子內立體選擇性氨基化生成五元環產物47，通過定向進化可對其催化的活性和選擇性進一步改善，生成產物的產率可達98%，ee值可達95%(Scheme 15)。

Scheme 15

上述文獻報道的C—H鍵氨基化主要發生在含有磺酸疊氮結構的化合物中。2015年，Fasan等[42]進一步報道了P450BM3的突變體P411BM3可有效地催化碳酸鹽疊氮化物48環化生成惡唑烷酮49(Scheme 16)。Wong等[43]利用細胞色素P450催化底物50分子內C—H胺化合成咪唑啉-4-酮51(Scheme 17)。

Scheme 16

Scheme 17

上述研究報道中，P450酶的突變體P411只能實現分子內的C—H鍵氨基化，即要求分子內含有氮源。2017年，Arnold等[2]發表的論文表明，P411BM3突變體P411CHA(A82L/A78V/F263L/E267D)可用于催化分子間的氨基化，并且擁有較好的催化活性以及立體選擇性(Scheme 18)。該工作為P450酶催化C—H鍵分子間胺化的研究做出了重大貢獻。

Scheme 18

Scheme 19

Scheme 20

2020年，Arnold等[44]通過對P450BM3進行改造后得到兩株突變體，P411BPA和P411APA。P411BPA可有效實現底物芐位C—H鍵的氨基化，而P411APA主要用于催化底物烯丙位C—H鍵的氨基化(Scheme 19)。

C—C鍵是有機化合物的中心結構。在有機化合物中通過C—H鍵的烷基化引入不同烷基基團，可以得到具有不同性質的化合物衍生物。但有關P450酶催化C—H鍵形成C—C鍵的報道有限。2008年，Fumihiko Sato等[45]利用細胞色素P450酶CYP80G2催化分子內的C—H鍵烷基化，實現分子內C—C鍵偶聯反應，將底物(S)-Reticuline轉化為產物(S)-Corytuberine(Scheme 20)。

Scheme 21

Scheme 22

Scheme 23

2018年，Seyedsayamdost等[46]利用P450催化分子內C—C鍵的偶聯反應，將P450酶OxyC與化學法級聯實現萬古霉素的合成。

在有機化合物中引入氟烷基基團可以顯著改變其藥理特性[47]。2019年，Arnold等[48]通過定向進化技術獲得P450突變體，可以催化氟烷基卡賓中間體插入底物C—H鍵中，可實現含氟烷基分子的對映異構體合成，ee值高達99%(Scheme 21)。該研究中開發的酶將為合成含氟生物活性分子開辟新的途徑，提供一種可將P450酶用于催化C—H鍵官能團多樣化的新思路。

2019年，Arnold等[3]采用定向進化技術對P450BM3的突變體P411進一步研究發現，通過改造得到的P450突變體能完成多種底物(包括苯基、烯丙基或α-氨基)的C—H鍵功能化。探索發現，通過卡賓插入C—H鍵實現分子間的烷基化，能獲得較高的轉化率和優良的選擇性(Scheme 22)。

2020年，Arnold等[49]通過對P411進行改造獲得了突變體P411-C10，可高效和高立體選擇性將內酯-卡賓轉移到74α-氨基位置的C—H鍵上生成產物76或77(Scheme 23)。

C—H鍵直接官能團化是構建C—X鍵合成新化合物最簡便的方法，具有較高的研究價值和廣闊的應用前景。目前，P450酶在催化C—H鍵選擇性官能團化中展現出巨大潛力，可高選擇性的催化C—H鍵官能團化，并可用于藥物分子中間體的合成，其中有關C—H鍵羥基化的研究較多，而通過C—H鍵的官能團化構建其他C—X鍵的研究相對有限。此外，P450酶因其活性低、穩定性差、輔酶依賴性等問題限制了其在實際中的應用，但是隨著分子生物學技術和酶工程技術的大力發展，P450酶的應用瓶頸有望逐步被打破，其將成為未來綠色化學發展中最具潛力的生物催化劑之一。