基于半導體聚合物納米粒子探針的比率型活性物種檢測
——推薦一個研究型綜合化學實驗

宋國勝，廖師夷，王友娟，宦雙燕

湖南大學化學化工學院，長沙 410082

半導體聚合物納米粒子(Semiconducting Polymer Nanoparticles，SPNs)是由疏水性半導體聚合物通過納米組裝的方法制備，并能直接分散在水溶液中的一種新型納米材料[1,2]。SPNs本身的特殊分子結構使其具有優異的光學性能，并具有高生物相容性和可降解性的特點，能夠很好地克服無機量子點中普遍存在的體內長期滯留和生物毒性等問題[3,4]。因而，SPNs在生物標志物的檢測上具有極大的優勢和潛力。

活性氧物種(Reactive Oxygen Species，ROS)是指機體內或者自然環境中含氧并且性質活潑的物質的總稱。常見的ROS包括H2O2、1O2、HClO、·OH、ONOO?等等[5–7]。生物體內ROS的正常水平對維持體內的氧化還原動態平衡起著重要作用。在外源刺激(如紫外線或X射線)的刺激下，ROS會劇烈產生，導致機體的氧化還原平衡失調[8,9]，進而發生一系列疾病，如癌癥、動脈粥樣硬化、心腦血栓等[10]。因此，高靈敏地檢測生物體內ROS的含量變化對于進一步了解其生理功能和準確診斷ROS相關疾病具有重要意義。

傳統單信號輸出的檢測方法易受到檢測過程中環境因素的干擾。與之相比，通過多信號輸出的比率型檢測方法，可使用多種不同信號相互參照，提高檢測的準確度，進而有望消除因探針濃度、光漂白、檢測設備等因素所造成的數據失真。因此，該方法在細胞和動物活體水平進行目標物檢測方面有著廣泛應用前景。

本實驗基于半導體聚合物(PFODBT)對ROS的高穩定性，將PFODBT作為信號參考分子，利用染料分子(IR775s)對ROS響應性變化的特性；將IR775s作為響應分子，并通過納米共沉淀法制備了有機聚合物納米探針(SPNs)。該納米探針通過比率型吸光度和比率型熒光的方法，實現對溶液中的ROS(ClO?和ONOO?)的高靈敏檢測。學生在應用光譜分析方法進行活性氧物種的檢測實驗中，不僅可以掌握紫外-可見吸收光譜儀和熒光光譜儀的使用方法和原理，而且鍛煉了分析和處理數據的能力，能夠引導學生養成勤于思考的習慣，并激發學生的創新能力。

1 實驗目的

1) 掌握納米共沉淀法制備有機納米粒子的原理、方法及表征手段。

2) 了解比率型吸光度和熒光檢測方法的基本原理、優勢及在分析檢測中的應用。

3) 了解紫外-可見吸收光譜儀和熒光光譜儀的結構和測量原理，掌握儀器基本操作方法。

4) 學會使用分析軟件處理和分析實驗數據(比率型計算以及檢測限計算方法)。

2 實驗原理

2.1 納米共沉淀法制備有機納米粒子的原理

如圖1所示，本實驗中使用有機半導體聚合物分子(聚[2,7-(9,9-二辛基芴)-alt-4,7-雙(噻吩-2-基)苯并-2,1,3-噻二唑]，簡稱PFODBT)、熒光染料分子(2-[2-[2-(β-羧乙硫基)-3-[2-(1,3-二氫-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亞烷基)-亞乙基-]-1-環己烯-1-基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓，簡稱IR775s)和表面活性劑(Pluronic F127，簡稱F127)通過疏水-疏水相互作用，自組裝形成納米粒子(PFODBT-IR775s)。

圖1 納米顆粒合成原理示意圖

2.2 比率型吸光度法的檢測原理

根據現有文獻報道，低濃度的ROS(ClO?/ONOO?)可選擇性地破壞IR775s分子結構，顯著降低IR775s的特征吸收峰和熒光強度[11,12]。然而，PFODBT對低濃度的ROS是相對穩定的。通過納米共沉淀法將PFODBT和IR775s自組裝成納米粒子后，PFODBT-IR775s納米探針同時具有兩者的特征吸收峰。IR775s的特征吸收峰(775 nm)作為響應信號，而PFODBT的特征吸收峰(550 nm)作為參考信號。隨著溶液中ROS的濃度加大，IR775s逐漸被破壞，775 nm處的吸收峰降低；同時PFODBT的特征吸收峰(550 nm)保持不變。根據兩處的吸光度的比值(A550/A775)的變化，實現對ROS的比率型吸光度檢測(圖2)。

圖2 有機納米探針比率型吸光度法檢測ROS示意圖

2.3 比率型熒光法的檢測原理

熒光能量共振轉移(FRET)是距離很近的兩個熒光分子間產生的一種能量轉移現象。當兩個熒光分子的距離在10 nm以內，并且供體分子的發射光譜與受體分子的吸收光譜重疊時，兩者可產生FRET，使得供體的熒光強度降低，而受體發射的熒光強度增強[13]。在納米探針PFODBT-IR775s中，由于PFODBT的熒光發射波長與IR775s的吸收波長相匹配，PFODBT的熒光能量轉移給IR775s，PFODBT的熒光發射強度(695 nm)將會降低。當ROS(ClO?/ONOO?)破壞IR775s后，PFODBT與IR775s之間的FRET效應減弱，導致IR775s熒光(825 nm)的降低和PFODBT熒光(695 nm)的恢復。根據695 nm和825 nm處的熒光強度比值(F695/F825)變化，從而實現對ROS的比率型熒光檢測(圖3)。

圖3 有機納米探針比率型熒光法檢測ROS示意圖

3 試劑與儀器

3.1 實驗試劑

聚[2,7-(9,9-二辛基芴)-alt-4,7-雙(噻吩-2-基)苯并-2,1,3-噻二唑](PFODBT)，2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氫-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亞基)-亞乙基]-1-環己烯-1-基]-乙烯基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓氯化物(IR775Cl)，Pluronic F127 (F127)購于Sigma-Aldrich。3-巰基丙酸購于梯希愛(上海)化成工業發展有限公司。二甲亞砜(DMSO)、三乙胺、無水Na2SO4、2-丙醇、二氯甲烷(CH2Cl2)、四氫呋喃(THF)、NaClO溶液、NaCl、NaNO2、HCl、H2O2、NaOH購于國藥集團化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。NaClO溶液和ONOO?溶液需現配現用，IR775s按文獻方法[12]合成。

3.2 實驗儀器

50 mL圓底燒瓶、血清瓶(5 mL、50 mL)、100 KD MWCO超濾管。其他大型儀器見表1。

表1 實驗儀器

4 實驗步驟

4.1 IR775s的合成

將IR775Cl (519.55 mg，1.0 mmol)，3-巰基丙酸(265 μL，3.0 mmol)和三乙胺(425 μL，3.0 mmol)依次加入到10 mL的DMSO (二甲亞砜)溶液中，之后在室溫條件下將混合溶液攪拌20 h。然后，加入二氯甲烷，并用氯化鈉飽和溶液洗滌整個混合液系統，分液后得到有機相。再將有機相經無水Na2SO4干燥，過濾并通過旋轉蒸發儀濃縮，獲得IR775s粗產物。最后，粗產物用硅膠柱色譜法純化(CH2Cl2/MeOH，體積比10 : 1)，得到綠色固體收集在離心管中，常溫避光儲存。圖4考慮到該部分時間較長，IR775s可由實驗教師提前制備。

圖4 合成染料分子IR775s的反應原理圖

4.2 IR775s水溶液的配制

在分析天平上準確稱取1 mg的IR775s固體于1.5 mL離心管中，加入1 mL DMSO，配成1 mg·mL?1的溶液。然后，取10 μL的IR775s/DMSO溶液，加至裝有90 μL超純水的1.5 mL離心管中，配成100 μg·mL?1的IR775s水溶液。用錫箔紙包封好離心管，放置于4 °C冰箱待用。

4.3 ROS溶液的配制

ONOO?溶液根據文獻報道配制[14]。為了配制ONOO?溶液，將5 mL的NaNO2溶液(0.6 mol·L?1)與350 μL的H2O2溶液(0.7 mol·L?1)混合，隨后在攪拌下加入250 μL的HCl溶液(0.6 mol·L?1)預酸化。再將上述溶液快速加入到10 mL的NaOH (1.5 mol·L?1)溶液中，混合均勻。進一步添加80 mg的MnO2除去過量的H2O2。最后，使用0.2 μm過濾器過濾溶液。所制備的ONOO?溶液，保存在?20 °C下備用。使用前，通過紫外-可見光譜儀測定ONOO?溶液的吸光度，并計算濃度(A=εbc，ε302nm= 1670 L·mol?1?cm?1，b= 1 cm)。

為了配制ClO?溶液，取58 μL NaClO溶液母液加入到4942 μL超純水中，得到濃度為10 mmol·L?1的ClO?溶液。

4.4 制備有機納米粒子(SPNs)

有機納米粒子按文獻報道過的方法合成[2]。首先，將PFODBT、IR775s、5 mg F127溶于1 mL THF中，在超聲條件下將其混勻(1–3 min)，然后將混合溶液快速注入到9 mL的超純水中(保持超聲狀態)，并繼續超聲8–10 min。之后，關閉超聲，停止反應，將超聲混合后的溶液轉移到50 mL的圓底旋蒸瓶中，在45 °C下旋蒸10 min (轉速100 r·min?1)至燒瓶中不再產生明顯氣泡。最后，將溶液加入到100 KD超濾管中，超濾清洗三次，放置在4 °C冰箱中，待用。其中，為了制備PFODBT納米粒子，將100 μg的PFODBT納米顆粒和5 mg的F127溶于1 mL THF中；為了制備PFODBT-IR775s納米粒子，將128 μg的PFODBT、384 μg的IR775s和5 mg的F127溶解于1 mL THF中。

4.5 透射電鏡(TEM)和動態光散射(DLS)表征

TEM樣品的制備：用移液槍吸取SPNs溶液，滴在一個干凈平滑的銅網片表面，使銅網片均勻的布滿一層潤滑的樣品溶液，在紅外燈照射下干燥銅網，直至銅網片表面的溶液完全干燥，再使用TEM進行觀察。

動態光散射制樣：將4 μL的100 μg·mL?1SPNs分散在1 mL的超純水中，超聲8–10 min。

4.6 比率型檢測溶液中ROS

為了檢驗納米探針的可行性，我們首先測試了IR775s水溶液和PFODBT納米顆粒分別對ROS的響應。

檢測ClO?：將20 μL的SPNs (100 μg·mL?1)分別與0–24 μL 2 mmol·L?1ClO?溶液混合，之后通過PBS緩沖液(pH = 7.4)補齊至250 μL，室溫下反應30 min后，分別測定這些溶液的紫外-可見光譜和熒光光譜。

檢測ONOO?：將20 μL的SPNs (100 μg·mL?1)分別與0–96 μL 500 μmol·L?1ONOO?溶液混合，之后通過PBS緩沖液(pH = 7.4)補齊至250 μL，室溫下反應30 min后，分別測定這些溶液的紫外-可見光譜和熒光光譜。

4.7 實驗過程中的注意事項

1) 納米探針在合成以及長期儲存時，需要避光，避免探針分子分解；

2) 由于使用某些有機溶劑，實驗操作需要在通風條件下進行；

3) 除去四氫呋喃時，旋轉蒸發時間應在10 min以上，以盡量除凈四氫呋喃。

5 結果與討論

5.1 染料分子IR775s的表征

將制備得到的IR775s固體溶于二氯甲烷中，注入電噴霧電離質譜儀。從質譜圖中可看出(圖5)，主峰為m/z= 607.3，與IR775s分子量相同，證明所得產物與目標產物一致。所合成IR775s的最大吸收峰在775 nm處(圖6a)，熒光發射峰在850 nm處(圖6b)。

圖5 染料分子IR775s的質譜圖

圖6 染料分子IR775s的紫外-可見光譜(a)以及熒光光譜(b)

5.2 有機納米粒子的表征

PFODBT-IR775s納米粒子具有良好的水溶性，其水溶液呈紫紅色，如圖7a所示。動態光散射(DLS)測量表明，PFODBT-IR775s納米粒子的平均水動力直徑為68 nm (如圖7b所示)。如圖7c所示的透射電子顯微鏡(TEM)結果表明，該納米粒子具有球形形貌。

圖7 PFODBT-IR775s納米粒子表征

5.3 可行性探究

如圖8a及圖8b紫外-可見光譜所示，隨著ROS (ClO?或ONOO?)濃度的增加，IR775s水溶液的特征吸收峰(775 nm)逐漸下降，說明IR775s易被ROS破壞。如圖8c及圖8d紫外-可見光譜所示，當ClO?或ONOO?濃度升高時，PFODBT的特征吸收度峰(550 nm)幾乎保持不變，說明PFODBT對于ClO?和ONOO?都是穩定的。PFODBT和IR775s對ClO?或ONOO?的不同響應特性，為開發比率型檢測ClO?或ONOO?的納米探針奠定了基礎。

圖8 (a) IR775s染料分子對ClO?的吸收光譜圖；(b) IR775s染料分子對ONOO?的吸收光譜圖；(c) PFODBT納米粒子對ClO?的吸收光譜圖；(d) PFODBT納米粒子對ONOO?的吸收光譜圖

5.4 納米探針比率型檢測ClO?

如圖9a吸收光譜所示，在沒有加入ClO?時，PFODBT-IR775s納米探針具有PFODBT和IR775s的特征吸收峰，說明成功合成了該納米粒子。隨著ClO?濃度的增強，IR775s的特征吸收峰(775 nm)的強度顯著降低，而PFODBT的特征吸收峰(550 nm)基本保持不變。根據圖9a，計算出吸光度在550 nm和775 nm的兩處信號的比值(A550/A775)，并繪制出A550/A775與ClO?溶液濃度的關系曲線。如圖9b所示，隨ClO?溶液濃度的增強，A550/A775逐漸增加。因此，基于這種比率型吸光度的變化可實現對ClO?檢測。

圖9 (a) 納米探針PFODBT-IR775s對不同濃度ClO?的吸收光譜圖；(b) 吸光度比值(A550/A775)與ClO?溶液濃度的關系曲線；(c) 納米探針PFODBT-IR775s對不同濃度ClO?的熒光光譜圖；(d) 熒光強度比值(F695/F825)與ClO?溶液濃度的關系曲線

如圖9c熒光光譜所示，在沒有加入ClO?時，PFODBT-IR775s納米探針在695 nm處的熒光發射峰較弱，說明PFODBT-IR775s之間存在較強的FRET效應。隨著ClO?濃度的增大，PFODBT-IR775s納米探針在825 nm處的熒光發射峰下降，而在695 nm處的熒光發射峰顯著上升。該現象說明ClO?可以逐漸破壞IR775s，導致PFODBT-IR775s之間的FRET效應降低，從而PFODBT在695 nm處的熒光強度逐漸恢復。根據圖9c，計算出熒光在695 nm和825 nm的兩處信號強度的比值(F695/F825)，并繪制出F695/F825與ClO?溶液濃度的關系曲線。如圖9d所示，隨ClO?溶液濃度的增強，F695/F825逐漸增加。通過擬合獲得線性方程(y= 0.29x+ 0.874)。相關性(R2= 0.946)說明在該濃度范圍內，納米探針的熒光強度的比率(F695/F825)與ClO?濃度呈良好的線性關系。并且根據公式可計算出該檢測方法的檢測限LOD = 3σ/k= 0.79 μmol·L?1。因此，基于這種比率型熒光變化可實現對ClO?檢測。

5.5 比率型檢測ONOO?

根據圖10a，計算出吸光度在550 nm和775 nm的兩處信號的比值(A550/A775)，并繪制出A550/A775與ONOO?溶液濃度的關系曲線。如圖10b所示，通過擬合獲得線性方程(y= 0.24x+ 2.071)。相關性(R2= 0.991)，并且根據公式可以計算出該檢測方法的檢測限LOD = 3σ/k =1.59μmol·L?1。

圖10 (a) 納米探針PFODBT-IR775s對不同濃度ONOO?的吸收光譜圖；(b) 吸光度比值(A550/A775)與ONOO?溶液濃度的線性關系曲線；(c) 納米探針PFODBT-IR775s對不同濃度ONOO?的熒光光譜圖；(d) 熒光強度比值(F695/F825)與ONOO?溶液濃度的線性關系曲線

根據圖10c，計算出熒光在695 nm和825 nm的兩處信號強度的比值(F695/F825)，并繪制出F695/F825與ONOO?溶液濃度的關系曲線。如圖10d所示，通過擬合獲得線性方程(y= 0.038x+ 1.169)。相關性(R2= 0.995)，并且根據公式可計算出該檢測方法的檢測限LOD = 3σ/k= 13.2 μmol·L?1。

6 實驗教學特點

本實驗內容緊密結合學科前沿，綜合運用多種方法原理、實驗技術和儀器設備，能夠使學生所學的知識融會貫通，同時培養學生的科研興趣。具有如下特點：

(1) 有機半導體聚合物納米粒子的制備屬于常溫反應，產率高，條件易于控制。反應時長對納米粒子形貌和性質影響不大，實驗重復性好。如果IR775s提前合成好，納米粒子的制備部分可在30分鐘內完成，符合本科生實驗學時的設計要求。

(2) 有機納米粒子檢測ROS的能力受到多種因素的影響，如投料比例、反應物濃度、表面活性劑等。因此，可讓學生探索不同實驗條件，研究其對檢測ROS靈敏度的影響，并分析影響規律。

(3) 通過引用熒光共振能量轉移原理，促進本科生對光譜分析知識的深入學習。比率型檢測是光譜分析中消除環境因素干擾的一種常用方法。在本實驗中，可將比率型檢測結果與單信號檢測結果進行對比，凸顯使用比率檢測的優勢。

(4) 本實驗中涉及多種實驗技術的綜合運用：IR775s的合成和表征既可放在實驗內，也可以提前準備好；納米粒子的形貌尺寸表征運用到動態光散射、透射電子顯微鏡的使用；光譜性能測試運用到紫外-可見光吸收譜儀和熒光光譜儀。

(5) 本實驗成功率高，可實施性強；既有敏感條件又有不敏感條件，通過學生對實驗條件的探索，培養實驗設計能力；通過完整的數據分析，提高學生實驗數據處理能力。實驗涉及大型儀器綜合使用，有利于擴展本科生視野，促進學生探究潛質的開發。本實驗所合成的納米粒子探針還可以進一步擴展到光譜分析的前沿領域，如在活體水平監測活性氧的含量。

7 思考題

(1) 比率型檢測有哪些優勢？

(2) 什么是熒光共振能量轉移？

(3) PFODBT/IR775s的投料比對探針特性如靈敏度有什么影響？

(4) 聚合物納米粒子探針用于光譜檢測，有哪些優點？

8 教學組織運行方式和教學方法

(1) 實驗學時安排和運行方式。

建議實驗分兩個階段進行：第一階段納米粒子的合成和表征；第二階段納米粒子檢測活性氧物質的測試。兩個階段共需約8 h (4 h + 4 h)。一堂實驗課中參與實驗的學生人數為10–15人，每人制取一個樣品。

(2) 線上線下混合式教學方法。

實驗課提前錄制好課程指導性短視頻，放到MOOC平臺或課程中心網站上，學生實驗前線上預習，了解實驗中應注意的問題，熟悉使用到的儀器設備原理、構造和操作技巧，完成預習的小練習。教師對學生的預習報告和提出的綜合設計方案進行指導，引導學生思考可能引起探針性質變化的幾種因素，并列出可能具體的實驗方案。如：

① 通過改變IR775s與PFODBT的摻雜比例(1 : 2/1 : 3/1 : 5)，研究摻雜比例對納米探針靈敏度的影響；

② 通過改變表面活性劑的量(2.5 mg/5 mg/7.5 mg)，研究表面活性劑的量對納米探針靈敏度的影響。

③ 通過改變表面活性劑的種類(PSMA/F127/DSPE-PEG)，研究表面活性劑的種類對納米探針靈敏度的影響。

現場實驗教學時，注意分組安排實驗條件設計，不同實驗條件既有平行對比，又有組內和組間對比，通過全體學生的實驗結果，獲得總的實驗規律和結論。實驗中注意采用啟發式引導，讓學生自主思考，培養創新意識。

實驗過程中和實驗結束后，組織學生進行實驗匯報，比較各種投料比例所制備材料的檢測靈敏度；有興趣的學生可參加教師的相關課題研究，并可在開放實驗中繼續進行探索。根據平時的開放實驗結果，又可應用于本科實驗教學中，可使該實驗的設計內容與時俱進，有較大的開放性。該實驗內容已經在本校的本科生SIT (大學生創新訓練)項目中進行了多次嘗試，實驗效果良好。

9 結語

本實驗采用納米共沉淀法制備了有機半導體聚合物納米粒子。基于PFODBT對ROS的高穩定性，將PFODBT作為信號參考分子；利用IR775s對ROS響應性變化的特性，將IR775s作為響應分子。該納米探針通過比率型吸光度和比率型熒光的方法，實現對溶液中的ROS (ClO?和ONOO?)的準確檢測。作為實驗課程教學，本實驗在方法上引入了光譜分析中熒光共振能量轉移原理和比率型檢測方法，使本科生了解比率型檢測方法對于單信號檢測方法的優勢，拓展了學生的能力；完整的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜測試訓練提升了學生使用基本光譜分析儀器的能力。比率型檢測以及檢測限的計算過程有利于訓練本科生的實驗數據處理能力，培養學生分析化學思維能力。靈活的實驗設計方案也能進一步激發學生的研究興趣，培養了學生的探索精神。該方法操作方便、可行性高，有利于培養學生的實驗技能和科研能力。