甘露糖受體與慢性乙肝患者肝纖維化的關系研究

李阿利 虞邦映 邵輝 陳華忠 章霞 溫壽向 朱堅勝

我國是全球乙肝感染率最高的國家之一。據報道，2016年我國慢性乙肝（chronic hepatitis B,CHB）患者約達3 000萬例[1]。肝纖維化是各種病因引起的慢性肝臟損傷后的瘢痕修復反應，是疾病進展為肝硬化的必經階段[2]，而肝星狀細胞激活是肝纖維化發生、發展的核心步驟[3]。甘露糖受體（mannose receptor,MR）是一種模式識別受體，在識別病原體、誘導細胞因子生成和保持機體內環境穩定中發揮重要作用，具有清除膠原蛋白的功能，與肝纖維化的形成密切相關[4]。近年來，MR成為國內外研究的熱點，關于MR與肝臟疾病的相關研究越來越多，但其與CHB患者肝纖維化關系研究較少。本研究采用免疫組化法和RT-PCR法檢測MR在CHB肝纖維化不同分期患者肝組織中的表達，以探討其在肝纖維化發生、發展過程中的作用，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年11月至2018年10月在浙江省臺州醫院感染科住院且行肝臟穿刺活檢的CHB患者 50例，其中男 28例，女22例；年齡 32～59（42.61±7.25）歲；肝纖維化分期：S0期 15 例，S1～2期 20 例，S3～4期15例。CHB肝纖維化不同分期組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（均 P ＞0.05）；ALT、AST、PLT 比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。納入標準：（1）年齡 30～60歲；（2）符合 2015年 CHB 防治指南中相關診斷標準[5]；（3）經B超定位引導下肝臟穿刺活檢術后肝組織病理學診斷明確為CHB。排除標準：（1）合并 HAV、HCV、HDV、HEV、HIV 感染；（2） 患有脂肪肝、酒精性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化、肝惡性腫瘤、遺傳代謝性肝病等疾病；（3）既往或近期接受過抗病毒治療；（4）妊娠或哺乳期婦女；（5）患有甲狀腺功能亢進癥、糖尿病等代謝疾病；（6）患有嚴重的心、肺、腦、腎等重要臟器疾病。本研究經本院醫學倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化分級評估 在超聲定位下，采用16 G穿刺針進行肝臟穿刺活檢術。取組織標本長度＞1 cm，常規行HE染色，由2位高年資病理科醫生獨立閱片進行診斷。參照2015年CHB防治指南[5]和1995年國際認可的Scheuer評分系統[6]對肝組織進行纖維化分期，分為S0～4期。其中S0期為無纖維化，S1～2期為輕度纖維化，S3～4期為中重度纖維化。

1.2.2 肝組織MR蛋白表達檢測 采用免疫組化法。將肝組織置于60℃恒溫烤箱中預熱2 h，切片，鋪平，常規脫蠟至水，梯度乙醇脫水；置于PBS中，沖洗3次，5 min/次；0.3% H2O2、37 ℃恒溫箱中孵育 15 min，消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次，5 min/次；0.01 M枸櫞酸鈉進行抗原熱修復，高壓15 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加兔抗人 MR抗體（1∶800一抗稀釋液稀釋），4℃冰箱內孵育過夜，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加兔鼠通用型二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次；DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，在光鏡下觀察并拍照。判讀標準：在光鏡下觀察，細胞質或細胞膜上棕黃色顆粒提示MR陽性表達細胞。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，每個視野下計算100個細胞中MR陽性表達細胞數，計算陽性細胞百分比并取平均值。染色強度評分：無染色為0分，淺黃色染色為1分，棕黃色染色為2分，棕褐色染色為3分；陽性細胞百分比評分：0%為0分，1%～為1分，26%～為2分，51%～為3分，76%～100%為4分；免疫組化評分為染色強度評分與陽性細胞百分比評分的乘積。根據免疫組化評分評估MR蛋白表達強度：＜2分為（-），2～3分為（+），4～6 分為（++），＞6分為（+++）。

1.2.3 肝組織 MR、NF-κB、轉化生長因子-β1（transforming growth factor,TGF-β1）、α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin,α-SMA）mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。采用Trizol法提取肝組織總RNA，按照兩步法RT-PCR試劑盒操作說明進行cDNA逆轉錄與PCR擴增，將PCR產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，觀察擴增條帶。引物序列見表2。采用2-ΔΔCt法計算肝組織 MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA 相對表達量，所有樣本均重復3個孔，取平均值。

表2 MR、α-SMA、NF-κB、TGF-β1及內參GAPDH引物序列

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；等級資料組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗。計量資料雙變量之間的相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CHB肝纖維化不同分期組患者MR蛋白表達比較 MR在CHB肝纖維化不同分期組肝組織上均有表達，主要表達于肝血竇內巨噬細胞的胞膜和胞質上，在肝臟內皮細胞、淋巴細胞的胞膜和胞質中也有部分表達，染色清晰，免疫組化結果見圖1（插頁）。隨著肝纖維化程度的加重，MR表達逐漸增強（P＜0.05），見表3。

表3 CHB肝纖維化不同分期組MR蛋白表達強度比較（例）

2.2 CHB肝纖維化不同分期組肝組織MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達比較 CHB肝纖維化不同分期組肝組織 MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達比較，差異均有統計學意義（F=32.50、24.35、96.42、54.37，均 P＜0.05）；與 S0組比較，S1～2組、S3～4組肝組織MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA 表達均明顯增加（均 P＜0.05）；與 S1～2組比較，S3～4組肝組織 MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA 表達均明顯增加（均 P＜0.05），見圖 2。2.3 CHB患者肝組織MR mRNA表達與NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達的相關性 CHB患者肝組織MR mRNA 表達與 NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA 表達均呈正相關（r=0.653、0.811、0.785，均 P＜0.05），見圖 3。

圖2 CHB肝纖維化不同分期組肝組織MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達比較（CHB為慢性乙肝；MR為甘露糖受體；TGF-β1為轉化生長因子-β1；α-SMA為α-平滑肌肌動蛋白；*P＜0.05）

圖3 CHB患者肝組織MR mRNA表達與NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達相關性的散點圖（CHB為慢性乙肝；MR為甘露糖受體；TGF-β1為轉化生長因子-β1；α-SMA為α-平滑肌肌動蛋白）

3 討論

慢性HBV感染是全球公共衛生問題之一。據WHO報道，全球HBV感染率約為3.5%[7]。據中國疾病預防控制中心統計，自1992年全面實行乙肝疫苗接種后，雖然母嬰垂直傳播率和嬰幼兒時期HBV感染率明顯降低，但是我國HBV攜帶者的比例仍較高[8]。

肝纖維化是CHB發展至肝硬化、終末期肝病甚至肝細胞癌的重要階段[9-10]。肝星狀細胞的活化是導致肝纖維化發展的關鍵環節[4]。TGF-β1是導致肝纖維化的關鍵因子，能激活肝星狀細胞并使之發生表型改變，從而表達大量α-SMA，促進細胞外基質的過度沉積與生成，最終形成肝纖維化[11-12]。另外，NF-κB具有轉錄激活功能，參與肝星狀細胞的活化調節，對纖維化的發生、發展起著重要作用[13]。本研究結果發現，肝組織NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達隨著肝纖維化程度增加而升高，進一步證實 TGF-β1、α-SMA、NF-κB 與肝纖維化嚴重程度密切相關。

MR是一種Ca2+依賴的1型跨膜蛋白受體，主要表達于巨噬細胞以及未成熟樹突狀細胞等免疫細胞表面，在調節免疫應答和維持糖蛋白穩態方面發揮重要作用[14]。MR結構中的FNⅡ成分可結合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白，具有清除膠原蛋白的功能，與肝纖維化發生、發展密切相關[5]。近年來，MR與肝臟疾病的研究也取得了一些進展。Ren等[15]研究發現，MR在肝癌組織中的表達明顯高于正常癌旁組織中的表達，且在肝硬化、TNM分期差、Child Pugh級別高的肝癌患者中表達更強；此外，肝癌組織中MR高表達者總生存率和無病生存率明顯降低。本研究采用免疫組化法檢測肝組織MR蛋白表達，發現MR主要表達在巨噬細胞的胞質和胞膜上，肝內皮細胞、淋巴細胞上也有分布；在S0期患者中有少量MR表達，在S1～4期患者中MR蛋白表達隨著肝纖維化程度的增加而增強。同時本研究還采用RT-PCR法進一步檢測了肝組織中MR mRNA表達，與免疫組化結果一致。

NF-κB在巨噬細胞中的激活后，可以在某些病理條件下將巨噬細胞驅動至M1或M2極化，并在疾病進展或消退中發揮重要作用[16]。Yeh等[17]研究發現三氧化礦物聚集體能通過 Axl、Akt、IKKa/b、IkBa 和 p65 的磷酸化激活Axl/Akt/NF-κB信號通路，誘導巨噬細胞向M2表型極化，上調 IL-10、TGF-β1、MR 表達，其中 MR表達呈時間依賴性增加；而AXL/Akt/NF-κB抑制劑可抑制M2相關細胞因子表達，使MR表達減少。NF-κB是M2巨噬細胞表型的關鍵調控因子，MR通常被認為是M2巨噬細胞的表面標志物，筆者推測MR與NF-κB可能共同參與疾病的發生、發展。本研究相關性分析結果顯示，MR mRNA 表達與 NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達呈高度正相關，提示MR可能通過NF-κB通路參與肝纖維化的發生、發展。

綜上所述，隨著肝纖維化程度的增加，CHB患者肝組織 MR 表達逐漸上調，且與 NF-κB、TGF-β1、α-SMA表達均呈正相關。筆者推測MR可能通過NF-κB通路參與肝纖維化的發生、發展，但其調控作用及具體機制有待后續細胞及動物實驗作進一步證實。