中藥單體調控氧化應激抗肝纖維化的機制和價值

周志文， 李 姍， 劉湘花， 李寧寧， 孫 寧， 祿保平

1 河南中醫藥大學 a.第二臨床醫學院， b.醫學院， c.中醫藥科學院， 鄭州 450046； 2 河南醫學高等專科學校， 鄭州 451191

我國慢性肝病患者人數眾多，部分患者最終發展為肝硬化，甚至肝癌。每年死于肝癌的患者高達30萬，約占全球肝癌總死亡人數的51%，肝病患者巨額的醫療負擔和勞動力的喪失給社會經濟發展造成沉重的壓力[1]。20世紀60至80年代，肝纖維化的病理學特征及其在慢性肝病中的作用得到普遍關注[2]。肝纖維化是機體對慢性肝損傷的一種修復反應，肝細胞發生壞死及炎癥時，肝臟中細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的增生與降解失去平衡，進而導致肝臟內纖維結締組織異常沉積。氧化應激與肝纖維化的形成進展密切相關，在多種病因所致的肝纖維化臨床病例和動物模型中均發現有氧化應激的參與[3]。

1 肝纖維化的病理特點

肝纖維化是諸多慢性肝病發展的必經階段和共同病理基礎。肝纖維化由酒精、病毒、寄生蟲、藥物、膽汁淤積等因素誘發，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)、單核細胞、Kupffer細胞、膽管上皮細胞、血管內皮細胞等參與，上皮間質轉化、炎癥、自噬、凋亡、氧化應激等機制交互，TGFβ/Smad、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)、核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等信號通路調控。HSC活化是ECM產生的前提，是肝纖維化形成的中心環節[4]。HSC靜止狀態下儲存維生素A，幾乎不分泌ECM。當肝臟受到慢性炎癥持續刺激時，Kupffer細胞、膽管上皮細胞、血管內皮細胞等損傷，通過旁分泌產生大量炎性因子如TGFβ、TNF、血小板衍生生長因子、結締組織生長因子等，進入Disse間隙激活HSC。活化的HSC表型及功能發生改變，轉變為肌成纖維細胞，并不斷增殖、分泌、合成大量Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)等ECM，促使肝臟纖維結締組織增生，引起早期肝纖維化的發生[5-6]。因此，ECM的過多蓄積是形成肝纖維化的主要原因。郭冶等[7]發現，在生理條件下，Disse間隙中ECM合成與降解穩態受基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)/金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP)之間的平衡影響，一旦MMP/TIMP之間平衡失調，將導致ECM降解減少和異常沉積，從而引起肝纖維化。

2 氧化應激促進肝纖維化的發生發展

氧化應激是氧化與抗氧化防御機制失衡而造成的細胞或組織毒性作用的過程?；钚匝醮?reactive oxygen species，ROS)和活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)是氧化還原反應產生的代謝產物。ROS包括氧自由基及其產物[8]，RNS包括氮自由基和非自由基[9]。兩者可由內外源性因素誘發而產生[10](圖1)。ROS/RNS不僅造成肝臟持續損傷，還可激活核因子E2相關因子2、TGFβ、NF-κB等相關信號分子及其下游通路，與其他機制級聯交互，共同促進肝纖維化的進展[11]。

2.2 肝纖維化時ROS/RNS清除不足 ROS/RNS既是氧化還原的代謝產物，也是肝纖維化過程中的病理產物。生理條件下，肝臟內產生少量的ROS/RNS，參與信號通路轉導、調節細胞周期、防御微生物[16]。在機體抗氧化系統的調節下，生成的ROS/RNS會被及時清除。當肝臟損傷或壞死后，有氧氧化產生的ROS/RNS大量釋放，其產生量超過了內源性抗氧化防御系統的清除能力，過多的ROS/RNS堆積引起脂質、蛋白質和DNA的過氧化損傷，誘導肝細胞炎癥反應和壞死，促進肝纖維化的發生[17]。肝纖維化時，炎癥和損傷狀態會導致氧化應激持續存在，從而引起內源性抗氧化酶SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽(glutathione，GSH)合成酶等明顯減少，引發肝臟組織氧化與抗氧化平衡失調，使肝臟內的ROS/RNS不能及時清除而蓄積在肝組織內，造成肝臟過氧化損傷而加重肝纖維化程度[18]。

3 中藥單體調控氧化應激信號通路抗肝纖維化

3.1 調控TGFβ/Smad信號通路 經典的促纖維化信號通路TGFβ/Smad中關鍵的轉導分子為胞質蛋白Smad，它可將TGFβ信號由跨膜受體(TGFβ Ⅰ、Ⅱ型受體)傳入細胞核內，調節核內基因轉錄[19]。肝纖維化時，肝細胞和活化的HSC可以產生TGFβ，TGFβ能夠促進TIMP的生成，從而抑制MMP的活性，ECM降解減少同時合成增加。TGFβ1還參與誘導HSC進一步分化為肌成纖維細胞[20]。米凱等[21]發現芒果苷可減輕CCl4造模大鼠肝損傷，降低透明質酸(hyaluronic acid，HA)、羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)、Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA水平，升高SOD水平，其機制可能與抑制TGFβ/Smad信號通路有關。Gui等[22]證實黃芪甲苷能降低CCl4造模大鼠肝組織HYP和丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，提高SOD和GSH水平，其抗肝纖維化作用與清除自由基、抑制活化的Kupffer細胞釋放TGFβ1有關。章圣朋等[23]發現夏枯草總三萜干預CCl4造模大鼠后，不僅能降低ALT、AST、HA、HYP、MDA水平，減輕肝臟病變程度，還可抑制肝組織中α-SMA、Smad2、Smad3等蛋白表達，從而阻斷肝纖維化進程。

3.2 調控MAPK信號通路 MAPK是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其介導信號由細胞表面受體，即受體酪氨酸激酶和G蛋白偶聯受體，轉導至細胞核內部。MAPK信號通路主要由胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶1/2/3(c-Jun N-terminal kinase 1/2/3，JNK1/2/3)、p38 MAPK(α/β/γ/δ)和ERK5構成，在調控細胞生長、分化、增殖、凋亡等方面發揮重要作用[24]。劉進鍇[25]用H2O2處理大鼠HSC-T6細胞后，ERK、JNK及p38 MAPK表達增加，柴胡皂苷可抑制HSC-T6細胞的增殖與活化及ECM的沉積，其作用是通過抑制氧化應激和抑制TGFβ1/MAPK信號通路而實現。葉蕾等[26]發現CCl4造模大鼠肝組織ERK、JNK和p38 MAPK均被激活，提示MAPK信號通路與HSC活化及肝纖維化發生密切相關。狗肝菜多糖能抑制肝纖維化大鼠MAPK信號通路的活化，降低血清HYP、NO含量，減少肝組織p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白表達，從而緩解肝纖維化進程[27]。

注：NOX，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶；iNOS，誘導型一氧化氮合酶。

3.3 調控PI3K/Akt信號通路 Akt，亦被稱為PKB，是PI3K下游的主要效應物。在PI3K/Akt信號通路中，當細胞受到生長因子和炎細胞刺激后，受體酪氨酸蛋白激酶活化，PI3K在質膜內側產生PIP3(phosphatidylinositol phosphate 3)，Akt與這些磷脂相互作用，導致其易位到PDK1(pyruvate dehydrogenase kinase 1)所在的內膜，完全活化的Akt被轉移到細胞核，參與下游分子的調控。PI3K/Akt信號通路對細胞周期、增殖、生長、存活及代謝具有重要作用，在肝系疾病研究中受到廣泛關注[28]。研究[29]證實，熊果酸能抑制大鼠HSC-T6細胞NOX亞基表達及PI3K/Akt信號通路的活化，下調TIMP-1蛋白表達，上調MMP-1蛋白表達。Mi等[30]發現麥芽酚能減輕造模小鼠肝組織的氧化應激反應，降低MDA水平并升高GSH及SOD水平，其緩解肝纖維化作用與抑制PI3K/Akt信號通路有關。

3.4 調控NF-κB信號通路 NF-κB屬于轉錄因子蛋白家族中的一員，包括p50/p105(NF-κB1)、p52/p100(NF-κB2)、RelB等亞基，各個亞基之間形成同源或異源二聚體，起主要調控作用的NF-κB是由p50和p65亞基組成的異源二聚體[31]。NF-κB在HSC活化中扮演著重要角色，是肝纖維化發生的調節器[32]。對血吸蟲性肝纖維化的研究[33]發現，在血吸蟲感染早期，NF-κB能夠顯著激活HSC，促進肝纖維化的發生。在CCl4造模小鼠中，NF-κB的激活可以導致HSC活化，而抑制NF-κB則可以減輕小鼠肝纖維化程度[34]。陳濤等[35]發現熊果酸能夠減輕血管緊張素Ⅱ誘導的HSC氧化應激水平，抑制ROS生成，下調AP-1(activator protein -1)及NF-κB的活性而抑制HSC活化增殖。陳磊[36]用紅景天苷干預CCl4造模小鼠后，小鼠肝組織SOD水平上升，MDA水平下降，NF-κB信號通路中p65蛋白水平降低，提示紅景天苷可通過減輕氧化應激、調控NF-κB信號通路達到抗肝纖維化效果。

3.5 調控Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin信號通路參與多種生長因子及其受體功能的調控，如TGFβ、血小板衍生生長因子及表皮生長因子受體等。水飛薊賓是中藥水飛薊的純化成分，具有較強的抗炎、抗氧化作用。黃靜[37]用水飛薊賓治療酒精性肝纖維化大鼠模型，發現肝組織中Wnt、β-catenin蛋白的表達量減少， MDA含量降低、SOD活性升高，有效減輕了肝纖維化程度。孫利兵[38]研究了沙苑子黃酮對CCl4造模小鼠肝纖維化的干預作用，發現其可降低血清ALT、AST水平，提高抗氧化能力并抑制膠原蛋白過度沉積，與抑制β-catenin的表達，干預Wnt信號轉導通路有關。

4 小結與展望

綜上所述，肝纖維化是一個由諸多致病因素相互作用且動態變化的病理過程。氧化應激及其介導的信號通路在肝纖維化發生發展階段扮演著至關重要的角色。中藥單體或活性成分通過調控TGFβ/Smad、MAPK、NF-κB、Wnt信號通路抑制氧化應激和炎癥反應，在減輕肝損傷、改善肝纖維化方面的療效已得到初步證實(表1)。但中藥單體往往多途徑、多靶點發揮作用，其抗肝纖維化分子機制非常復雜，需要進一步通過體內外實驗探討藥物代謝過程及作用機制交互網絡。其次，中醫重視辨證論治、三因制宜的理念，在肝纖維化的不同階段，對于不同的患者出現不同的證型，一味單體很難直接祛除病因、改善癥狀，應針對不同患者證型配合不同單體合劑辯證治療，結合病理檢測及分子生物學指標評價療效。最后，臨床上對于肝纖維化尚未形成規范的預防治療體系，患者易忽視早期肝纖維化的危害，未采取合理有效的干預措施，易使病情惡化。因此臨床治療應建立分階段、多層次、規律性的治療體系，以期在治療肝纖維化方面取得顯著的成果，為臨床用藥提供更多依據。

表1 中藥單體或活性成分干預氧化應激的信號通路

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：周志文負責文章思路設計，撰寫論文；李姍負責課題設計，修改論文；李寧寧、劉湘花、孫寧負責文獻檢索，整理參考文獻；祿保平負責擬定寫作思路，指導撰寫文章及最后定稿。