基于正交試驗的咖啡種殼發酵制備乙醇工藝優化研究

陳 旋，魯秀才，2，吳 丹，2，楊 延，2

（1.滇西科技師范學院生物技術與工程學院，云南 臨滄 677000；2.云南省紅茶工程技術研究中心，云南 臨滄 677000）

1 材料與方法

1.1 材料

咖啡種殼：取自云南省臨滄市云縣幸福鎮咖啡廠咖啡豆濕法加工后的咖啡廢棄物，去除種殼中的咖啡豆，密封于4℃冰箱貯藏，其中：粗蛋白（7.31±0.05）%，粗脂肪（2.67±0.04）%，灰分（8.15±0.01）%，水分（8.98±0.08）%，粗纖維（20.44±0.06）%，總糖（18.4±0.05）%。

菌種：釀酒曲（安琪酵母股份有限公司）。

1.2 試劑

無水乙醇：優級純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

重鉻酸鉀：天津市風船化學試劑科技有限公司等。

無水乙醇、重鉻酸鉀：均為分析純。

1.3 儀器與設備

主要儀器設備：由上海申安醫療器械廠生產的LDZF 50KB-LLL型立式壓力蒸汽滅菌鍋；由上海舜宇恒平科學儀器有限公司生產的754紫外可見分光光度計；由上海安亭科學儀器廠生產的TDL-4型臺式離心機；由上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產的HHS型數顯電熱恒溫水浴鍋；由上海智城分析儀器制造有限公司生產的ZHWY-211D型恒溫培養振蕩器；由上海精科有限公司生產的PHS-3C型pH計。

1.4 試驗方法

1.4.1 稀酸預處理

稱取10 g咖啡種殼，按液固比8∶1加入3.50%硫酸，在110℃的條件下水解處理90 min，即咖啡種殼稀酸預處理水解液。

1.4.2 咖啡種殼發酵培養基

將預處理后的水解液進行過濾，收集濾液50 mL置于發酵瓶中，調節pH為5，在115℃的條件下滅菌30 min。

1.4.3 咖啡種殼發酵乙醇體積分數的測定

采用重鉻酸鉀氧化分光度法測定咖啡種殼發酵液中乙醇的含量。取2 mL發酵液于離心管中，以3 000 rpm/min轉速離心2 min，取上清液1 mL于25 mL試管中，加5%的K2Cr2O7溶液2 mL，沸水浴10 min顯色，迅速冷卻至室溫，加無菌水定容至10 mL，混合均勻，在590 nm處測定吸光值。以無水乙醇為標準品制作標準曲線，從標準曲線求出測定樣品中乙醇含量。試驗得到標準曲線回歸方程：y=5.565 2x+0.023 1（R2=0.999 3）。

1.4.4 單因素試驗

在無菌操作臺內，于咖啡種殼發酵培養基中接種10%釀酒曲攪拌均勻，溫度為35℃，在80 rmp/min轉速下培養發酵。分別考察發酵時間為24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，接種量為5%、8%、10%、12%、15%，氮源為硫酸銨、磷酸二氫銨、酵母浸粉、蛋白胨、尿素時，對咖啡種殼發酵乙醇體積分數的影響。

1.4.5 正交試驗設計方案

在單因素試驗的基礎上，選取接種量、發酵時間、磷酸二氫銨3個因素，利用正交試驗設計法對咖啡種殼發酵乙醇的工藝進行優化，試驗因素及水平編碼如表1所示。

表1 正交試驗因素及水平編碼Tab.1 The orthogonal test factors and level codes

1.4.6 統計分析

采用SPSS 17.0數據處理軟件，對試驗數據進行統計分析，每組試驗重復3次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵時間對咖啡種殼發酵制備乙醇的影響

當發酵時間為24 h時，乙醇體積分數最大為2.20%，故咖啡種殼發酵制備乙醇最佳時間為24 h。

2.1.2 接種量對咖啡種殼發酵制備乙醇的影響

接種量是發酵的基礎，影響發酵效率和發酵效果，當接種量過多時，會提高發酵液的黏稠度，且受空間限制，不僅會減少菌種彼此之間的相互作用，還會減少發酵材料的接觸面。同時，受底物營養物質的限制，接種量過多會造成菌種之間的相互競爭，大部分營養物質用于自身的供能，從而大大降低了乙醇的產生。如果接種量太少，底物中的營養物質被菌種用于生長繁殖，使底物中的糖源下降，發酵時間延長導致乙醇降低。同時，在發酵過程中，接種量的大小會影響酵母的生長，進而影響酒精發酵。結果如圖1所示，在5%的接種量條件下，乙醇的體積分數最大，為2.41%，故最佳接種量為5%。

圖1 接種量對乙醇體積分數的影響Fig.1 The effect of inoculation amount on ethanol volume fraction

2.1.3 不同氮源對咖啡種殼發酵制備乙醇的影響

氮源是生物體核酸、蛋白質和其他氮素化合物的構成材料。合適的氮源及其濃度，有利于菌種的生成，促進代謝產物的合成和分泌。氮源可分為有機、無機，根據二者組成的復雜程度以及是否有利于釀酒曲的基本營養需求，發酵培養基的氮源一般選擇無機氮源。最為常見的無機氮源有硫酸銨和尿素，本試驗選擇硫酸銨、硫酸氫二銨、酵母提取液、蛋白胨、尿素5種氮源作為研究對象。結果磷酸氫二銨的乙醇體積分數為3.30%，高于其他氮源，故最源為磷酸氫二銨。

2.2 正交試驗優化結果

根據單因素試驗結果，選取接種量（A）、發酵時間（B）和磷酸氫二銨（C）3個因素，以乙醇體積分數為指標，采用L9（3）4正交表進行正交試驗，結果如表2所示，各因素對乙醇體積分數影響的主次順序為A＞B＞C。通過方差分析法，咖啡種殼發酵制備乙醇的最優工藝條件為A3B1C1，即接種量為25%，發酵時間12 h，磷酸二氫銨為0.1%。

表2 正交試驗結果Tab.2 The orthogonal test results

由于尿素對咖啡種殼發酵制備乙醇的影響最小，以尿素為誤差所在列考慮接種量、發酵時間的顯著性，由表3可以看出接種量對咖啡種殼發酵制備乙醇的影響顯著。

表3 正交試驗方差分析Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

2.3 驗證試驗

對方差分析法所得優化條件進行驗證試驗，乙醇體積分數為2.80%。故咖啡種殼發酵制備乙醇的最佳方案為A3B1C1。即接種量為25%，發酵時間12 h，磷酸二氫銨為0.1%。

3 結論

本試驗以咖啡種殼為原料，通過對影響咖啡種殼發酵制備乙醇的3個因素（接種量、發酵時間、氮源）進行單因素試驗，在此基礎上進行正交試驗，確定咖啡種殼發酵制備乙醇最優工藝條件是接種量為25%、發酵時間12 h、磷酸二氫銨為0.1%，實際測定乙醇體積分數為2.80%。表明選擇設計合適的發酵工藝條件對提高乙醇含量至關重要，可為生物質能源乙醇的大規模工業化生產提供相應的工藝參數和理論依據，同時也為咖啡加工后廢棄物的綜合利用和深入研究奠定了基礎，避免了資源浪費。