一株豬鏈球菌的分離鑒定及其防治

王隆柏 鄭麗英 陳秋勇 吳學(xué)敏 陳如敬 車勇良 周倫江

摘 要：從福建某發(fā)病規(guī)模豬場(chǎng)保育豬的肺臟中分離到1株細(xì)菌，根據(jù)分離細(xì)菌的形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)、培養(yǎng)特性、PCR鑒定和動(dòng)物攻毒試驗(yàn)，結(jié)合發(fā)病豬的臨床癥狀和病理變化，表明該分離菌為偏向厭氧型鏈球菌，具有在血平板上培養(yǎng)良好且能致小白鼠發(fā)病死亡等特性。藥敏試驗(yàn)表明：分離鏈球菌對(duì)萬(wàn)古霉素、亞胺培南、利奈唑胺和菌必治高度敏感，對(duì)阿莫西林、氟苯尼考、頭孢噻肟、呋喃妥因和替加環(huán)素中度敏感，對(duì)卡多西環(huán)素、多粘菌素、青霉素、鏈霉素、恩諾沙星等藥物不敏感。豬場(chǎng)根據(jù)藥敏結(jié)果，采取緊急防治措施，疫情5 d后得到有效控制。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌;分離鑒定;防治

中圖分類號(hào)：S 852.61 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ??文章編號(hào)：0253-2301（2021）07-0026-04

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.07.004

Isolation， Identification and Prevention of a Strain of ?Streptococcus Suis

WANG Longbai1， ZHENG Liying2， CHEN Qiuyong1， WU Xuemin1，CHEN Rujing1， CHE Yongliang1， ZHOU Lunjiang1*

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Fujian Academy of Agricultural

Sciences， Fuzhou， Fujian 350013， China; 2. Yanping District Center of Animal

Disease Prevention and Control， Nanping， Fujian 353000， China）

Abstract： A bacterial strain was isolated from the lungs of weaned pigs in the infected intensive pig farm in Fujian Province. According to the morphological observation， biochemical test， cultural characteristics， PCR identification and animal challenge test of the isolated bacteria， and combined with the clinical symptoms and pathological changes of the infected pigs， it was indicated that the isolated bacteria was partial to anaerobic ?Streptococcus， ?which had the characteristics of good culture on blood plate and could cause the disease and death of mice. The drug sensitivity test showed that the isolated ?Streptococcus ?was highly sensitive to vancomycin， imipenem， linezolid and rocephin， and was moderately sensitive to amoxicillin， florfenicol， cefotaxime， macrodantin and tigecycline， while was not sensitive to the drugs such as cardoxycycline， polymyxin， penicillin， streptomycin， and enrofloxacin. According to the results of drug sensitivity， the pig farm should take emergency prevention and control measures， and the epidemic could be effectively controlled 5 days later.

Key words： ?Streptococcus ?suis; Isolation and identification; Prevention and treatment

自2018年我國(guó)首次報(bào)道發(fā)生非洲豬瘟以來(lái)，各規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)都強(qiáng)化了生物安全防控措施和疫病綜合防控舉措，豬場(chǎng)發(fā)生病毒性傳染病（如豬流行性腹瀉、圓環(huán)病毒病等）的情況有所減少。但由于如今在飼料中全面禁抗和對(duì)細(xì)菌性疾病防控的疏忽[1]，導(dǎo)致發(fā)生豬細(xì)菌性的疾病有所增加，比如脹氣梭菌和豬鏈菌病等。豬鏈球菌病（Strep tococcosis swine ）是由不同群的鏈球菌引起的不同臨床癥狀傳染病的總稱[2]。該病病原主要為C群的獸疫鏈球菌及類馬鏈球菌、D群的豬鏈球菌、以及E、L、S、R等群[3]，一年四季均可發(fā)生，但在悶熱潮濕的天氣更多發(fā)。根究豬群感染鏈球菌的臨床表現(xiàn)，可分為腦膜炎型、敗血型、化膿性關(guān)節(jié)炎型及淋巴結(jié)炎型等[4]。

2020年8月，福建某存欄約600頭母豬的規(guī)模豬場(chǎng)，保育豬出現(xiàn)發(fā)病和死亡，發(fā)病率達(dá)30%，死亡率達(dá)12%，臨床癥狀主要表現(xiàn)為食欲減退、體溫升高、呼吸困難和個(gè)別頭往后仰等神經(jīng)癥狀;經(jīng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，及對(duì)分離菌的形態(tài)學(xué)觀察、生化和PCR鑒定、動(dòng)物攻毒和藥敏試驗(yàn)，證實(shí)分離到1株豬鏈球菌。豬場(chǎng)根據(jù)診治結(jié)果，采取緊急防控措施，疫情最終獲得有效控制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2頭疑似發(fā)病保育豬的肺臟來(lái)源于福建某發(fā)病規(guī)模豬場(chǎng);普通瓊脂板、綿羊血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所自制;革蘭氏染色試劑和生化試劑購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;藥敏試紙購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)有限公司;昆明小白鼠購(gòu)自閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 在超凈臺(tái)內(nèi)用細(xì)菌接種針在病死豬肺臟劃線接種于血瓊脂平板，然后放置在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。選取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色后觀察細(xì)菌的形態(tài)特點(diǎn)。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)特征 將分離菌接種于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和普通瓊脂平板各2組，分別放置于有氧和厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 細(xì)菌生化鑒定 按生化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定。將細(xì)菌分別接種于葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、肌醇、木糖、鼠李糖、棉仔糖、硫化氫、靛基質(zhì)等生化鑒定管中，培養(yǎng)18～24 h觀察生化鑒定結(jié)果。

1.2.4 細(xì)菌PCR鑒定 按參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。根據(jù)豬鏈球菌16S rRNA設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為688 bp。

1.2.5 動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 將8只昆明小白鼠，分成2組，分別為試驗(yàn)組和對(duì)照組各4頭。試驗(yàn)組通過(guò)腹腔接種分離菌液（1×107 CFU·mL-1）0.2 mL·只

-1，對(duì)照組每只分別注射等劑量的生理鹽水。兩組分別隔離飼養(yǎng)觀察。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片擴(kuò)散法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，取100 μL細(xì)菌液（1×107 CFU·mL-1）涂布于血平板培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基面貼上不同藥敏紙片，置于37℃培養(yǎng)24 h后，按說(shuō)明判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病豬臨床癥狀和病理變化

發(fā)病豬只的臨床癥狀主要表現(xiàn)為食欲不振或廢絕，精神沉郁（圖1），體溫為40～42℃，鼻腔有漿性鼻汁流出，腹式呼吸，個(gè)別出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)，四肢劃水，頭往后仰等神經(jīng)癥狀，瀕死體溫下降;病理變化主要表現(xiàn)為肺臟出血、肉變（圖2）和腦膜充血，淋巴結(jié)腫大、出血，腎臟有出血點(diǎn)。

2.2 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

從病料的肺臟中分離到1株細(xì)菌，該細(xì)菌在鮮血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24 h后，長(zhǎng)出半透明、圓形、光滑、邊緣整齊的溶血性菌落（圖3）;革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體呈圓形，短鏈，主要以5～18個(gè)菌體鏈狀排列，可見單個(gè)長(zhǎng)達(dá)20個(gè)以上菌體相連的長(zhǎng)鏈狀（圖4）。

2.3 細(xì)菌培養(yǎng)特征

經(jīng)不同培養(yǎng)基和不同環(huán)境下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該菌在麥康凱瓊脂平板無(wú)論是在厭氧還是在有氧條件下都不能生長(zhǎng)，在普通瓊脂平板可生長(zhǎng)、鮮血平板培養(yǎng)在厭氧比有氧條件下生長(zhǎng)更好。

2.4 細(xì)菌生化鑒定

培養(yǎng)18 h后觀察生化鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該菌可發(fā)酵蔗糖、果糖、肌醇、葡萄糖和乳糖;不能發(fā)酵甘露醇、山梨醇、鼠李糖、麥芽糖、木糖、硫化氫、棉仔糖和靛基質(zhì);以上生化鑒定符合鏈球菌生化特性。

2.5 細(xì)菌PCR鑒定

分離菌經(jīng)PCR反應(yīng)，獲得大約688 bp大小的目的條帶，與預(yù)期大小一致（圖5）。

2.6 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)

分離細(xì)菌接種小白鼠12 h后，開始出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神沉郁、被毛蓬松等臨床癥狀，2只小白鼠在接種細(xì)菌48 h內(nèi)死亡。對(duì)照組小白鼠正常。

2.7 藥敏試驗(yàn)及防治

分離鏈球菌對(duì)萬(wàn)古霉素、亞胺培南、利奈唑胺和菌必治高度敏感，對(duì)阿莫西林、氟苯尼考、頭孢噻肟、呋喃妥因和替加環(huán)素中度敏感，對(duì)卡多西環(huán)素、多粘菌素、青霉素、鏈霉素、恩諾沙星等藥物不敏感。

該豬場(chǎng)根據(jù)藥敏結(jié)果，選用中敏的氟苯尼考對(duì)全場(chǎng)豬群通過(guò)飲水進(jìn)行治療，對(duì)發(fā)病豬群注射阿莫西林每天1次，連續(xù)2 d，同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、環(huán)境消殺，5 d后疫情得了有效控制。

3 結(jié)論與討論

3.1 本研究對(duì)病料進(jìn)行了豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等病毒性疾病檢測(cè)，結(jié)果都為陰性，從病料的肺臟中分離到1株細(xì)菌，通過(guò)對(duì)分離細(xì)菌的形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)和PCR鑒定，該細(xì)菌為偏向厭氧的革蘭氏陽(yáng)性球菌，在鮮血瓊脂平板上培養(yǎng)良好，在麥康凱瓊脂平板上不生長(zhǎng)，與劉玉濤等[6]于2014年分離報(bào)道的細(xì)菌具有類似特性。根據(jù)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果，結(jié)合豬場(chǎng)的發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化和治療效果，確診該豬場(chǎng)發(fā)生疫病的病原主要為鏈球菌病。究其發(fā)病原因，主要是在飼料中全面禁止使用抗生素后，雖然規(guī)模豬場(chǎng)加強(qiáng)了生物安全防控措施，通過(guò)除臭改善了飼養(yǎng)環(huán)境，但在細(xì)菌病防控的思想上出現(xiàn)了松懈，導(dǎo)致在豬場(chǎng)出現(xiàn)細(xì)菌性疾病的概率有所增加。

3.2 根據(jù)小白鼠攻毒試驗(yàn)表明，該分離菌株對(duì)小白鼠具有較強(qiáng)的致病性，48 h內(nèi)可導(dǎo)致小白鼠死亡，說(shuō)明該分離菌有較強(qiáng)毒力。在一定的條件下，豬場(chǎng)如飼養(yǎng)管理?xiàng)l件較差，豬群免疫功能較低和氣候變化等應(yīng)激因素較大的情況下，可能導(dǎo)致保育豬的急性發(fā)病和死亡。鑒此，各規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)該加強(qiáng)細(xì)菌性疾病防控措施，做好環(huán)境消殺工作，加強(qiáng)臭管理，改善飼養(yǎng)環(huán)境，提高豬群免疫力[7]，確保豬群健康養(yǎng)殖。

3.3 在非洲豬瘟背景下，豬群疫病防控策略有所改進(jìn)，在生豬養(yǎng)殖生物安全防控措施方面得到很大加強(qiáng)，這有利于減少病原傳播，防堵疫情暴發(fā)。豬鏈球菌病在我國(guó)于20世紀(jì)50年代開始報(bào)道，雖然現(xiàn)已有商品的疫苗，但由于豬鏈球菌的血清型眾多和抗生素可以防治的特點(diǎn)，導(dǎo)致豬場(chǎng)使用疫苗的頻率較少。因此，建議各規(guī)模豬場(chǎng)在建立并執(zhí)行嚴(yán)格的生物安全措施情況下，也要重視并做好各種疫苗的免疫和保健工作，提高豬群免疫功能;另外，規(guī)模豬場(chǎng)對(duì)于細(xì)菌性疾病的防控，在選用防治藥物的環(huán)節(jié)方面，最好采用科學(xué)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)藥敏藥物做到有針對(duì)性的防治，這在豬場(chǎng)取得良好防控效果的同時(shí)，有利于減少細(xì)菌耐藥和確保豬肉食品安全，有利于促進(jìn)生豬產(chǎn)業(yè)健康高效發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1]王文，范方程，鄧瑞德，等.湖南湘潭某豬場(chǎng)保育豬鏈球菌分離鑒定及耐藥性試驗(yàn)[J].養(yǎng)豬，2021（3）：101-103.

[2]梁學(xué)勇.動(dòng)物傳染病[M].重慶：重慶大學(xué)出版社，2007.

[3]耿艷紅，徐軍，王兆山，等.豬鏈球菌病[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26（9）：101-104.

[4]郭長(zhǎng)明，陳懷君，朱善元，等.廣西某豬場(chǎng)豬鏈球菌分離鑒定及其生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2021，48（2）：736-746.

[5]幸文定，曾文斌，劉悅欣，等.一起豬鏈球菌病的臨床分離鑒定及診治[J].養(yǎng)豬，2015（1）：92.

[6]劉玉濤，吳秋玉，王隆柏，等.一株豬鏈球菌的分離與鑒定[J].福建畜牧獸醫(yī)，2014，36（4）：20-21.

[7]胡換儀，林敏，劉小蘭，等.一例豬鏈球菌病的診斷及其病原分離鑒定[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，2021（1）：9-12.

（責(zé)任編輯：柯文輝）