基于Zinc-ZIP8-MTF1軸研究獨活寄生湯治療膝骨關節炎的作用機制

趙小敏，李 多，朱明雙，黃 勇，曹紀輝

(1.四川省南充市中醫醫院骨傷科，四川 南充 637001；2.成都中醫藥大學中醫骨傷科學教研室/成都中醫藥大學附屬醫院骨傷科，四川 成都 610072；3.重慶市長壽區中醫院骨傷科，重慶 401220)

膝關節骨性關節炎(KOA)主要以疼痛、活動受限為臨床表現，其病理表現為軟骨的變性破壞為主。目前學術界普遍認為KOA的發生與發展是一個慢性、長期、漸進且不可逆的病理過程。流行病學調查顯示，KOA在全球的患病率為4%～13%，隨著人口老齡化的進程加快，KOA患病率日漸增高[1]。傳統中醫藥在治療KOA中發揮著重要且不可替代的作用，其中獨活寄生湯作為治療KOA的經典名方，臨床效果明顯，在臨床中為眾多醫家運用[2，3]。研究發現[4]，Zinc-ZIP8-MTF1軸的激活在膝骨關節炎軟骨退變中發揮了重要作用。本課題組前期研究發現[5]，獨活寄生湯可以抑制炎性狀態下軟骨細胞內Zn2+的濃度。本研究通過KOA模型動物，探索獨活寄生湯在治療膝骨關節炎中的作用機制，及與Zinc-ZIP8-MTF1軸在該機制中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料2018年5月至2020年12月本研究在岐黃博恩生物科技有限公司實驗室完成。C57BL/6小鼠54只(均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK(湘)2016-0002)。藥品與試劑：獨活寄生湯藥液；水合氯醛；乙二胺四乙酸二鈉鹽；BCA蛋白濃度測定試劑盒；Anti-beta Actin antibody；二抗羊抗兔；Metallothionein Monoclonal Antibody；SLC30A9 Polyclonal Antibody；SLC39A8 Polyclonal Antibody；MTF1 Polyclonal Antibody；Animal Total RNA Isolation Kit；RT EasyTMⅡ；FluoZin-3 AM；Pluronic F-127；TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit；SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix；番紅-固綠染液。

1.2 動物模型制作參考文獻[6，7]制作，采用7%水合氯醛行腹腔麻醉實驗小鼠，選取小鼠右后膝關節作為操作模型，采用聚維酮碘和酒精對小鼠右后膝關節消毒；在顯微鏡下用小尖刀取髕旁內側切口顯露膝關節，手術過程為減少失血，當有出血時，進行壓迫止血，小心打開關節腔，注意操作過程中動作不可粗暴，不破壞膝關節內其它軟組織，用鉗子將髕骨向外側脫位，在手術過程中，為防止關節軟骨表明變干，可在關節軟骨表面滴入無菌生理鹽水，在確保不損傷關節軟骨和韌帶的情況下，用 10 號手術刀片切斷膝關節內側半月板，將髕骨復位，關閉切口前，給予 0.25%布比卡因1滴，滴于手術部位以減少術后疼痛，用6-0絲線逐層閉合切口，縫合皮膚，結束手術。

1.3 動物分組處理將54只小鼠隨機分為獨活寄生湯組(DHJST組)、對照組(Model組)、空白組(Control組)各18只。本實驗選取造模4周時間點開始給藥，DHJST組予獨活寄生湯灌胃，Model組、Control組用0.9%氯化鈉溶液替代。獨活寄生湯劑量為1.86 g/ml×10 ml。每次灌胃后觀察實驗小鼠一般狀態。在給小鼠灌胃4周后，脫頸處死實驗動物，并分別取小鼠右后膝關節軟骨檢測相關指標。實驗中，因意外死亡2只小鼠(Model組和DHJST組各1只)，實驗結束后，將每組小鼠再分為兩組，其中一組取小鼠完整膝關節用于病理學檢查和Zn2+濃度檢測，每組用于病理學檢測8只，熒光染色檢測3只，實時熒光定量(Real Time Quantitative PCR，RT-qPCR)檢測3只和 Western blotting檢測3只。

1.4 病理組織學檢測用無菌手術刀切開右后膝關節周圍皮膚，用無菌剪刀在右后膝關節上下各1 cm處將小鼠股骨、脛腓骨剪斷，然后用無菌剪刀在不損傷膝關節和周圍關節囊的基礎上將膝關節周圍肌肉小心剔除，放入中性甲醛液中固定，采用10%EDTA-2Na 將膝關節脫鈣8周，固定小鼠膝關節脫水切片，滴加固綠染色3分鐘左右，清洗切片1～3分鐘，將多余的染料沖掉，在切片上滴加媒染劑處理10～30秒，再用自來水清洗1～3分鐘，并在切片上滴加番紅染液染色0.5～2分鐘，直至軟骨染著鮮紅色后，用自來水清洗1～3分鐘，最后脫水各3～5分鐘回后封片。所有小鼠膝關節均按病理檢驗SOP程序嚴格操作。最后鏡檢對小鼠膝關節進行觀察并采集圖像，本研究采用關節炎經典評分標準OARSI對已采集圖像進行等級評分，以區別不同組別之間的KOA嚴重程度[8，9]，該等級從輕到重分為6個等級。

1.5 熒光染色技術檢測軟骨組織內ZN2+將用于熒光染色經過脫鈣的小鼠膝關節取出，放入預冷的冰凍切片機中(-20 ℃)，并制備10 μm厚的冰凍切片，然后采用5 μM FluoZin-3 AM和0.1% Pluronic F-127(Invitrogen)處理冰凍切片；30分鐘后，PBS液中洗滌，PBS溶液中繼續孵育30分鐘，整個實驗處理過程必須保持在恒溫37 ℃。最后，通過熒光顯微鏡觀察膝關節軟骨細胞內Zn2+成像。以驗證獨活寄生湯在小鼠膝骨關節炎動物模型體內對軟骨細胞 Zn2+濃度的影響。

1.6 RT-qPCR用無菌手術剪刀小心剪取小鼠脛骨平臺內側軟骨組織，提取總RNA，測RNA溶度濃度和純度，RT EasyTMⅡ試劑盒逆轉錄cDNA，檢測目標mRNA相對表達量。對同一樣品中每個差異表達的 mRNA 的表達量進行歸一化處理。測定鋅轉運蛋白(ZIP8、ZNT9)、金屬調節轉錄因子(MTF1)、基質金屬蛋白酶-3(MMP3)、基質金屬蛋白酶-13(MMP13)mRNA的表達量。

1.7 Western blotting采用液氮研磨法，將膝關節軟骨放入研缽，不斷將液氮倒進研缽中，用研杵在超低溫下將膝關節軟骨持續研磨，小心收集研磨至粉末狀軟骨，提取其總蛋白，經處理后圖像灰度值掃描，檢測膝關節軟骨組織中ZIP8、ZNT9、MTF1、MMP3、MMP13 mRNA 的蛋白表達。

1.8 統計學方法采用 GraphPad Prism 8.3軟件分析數據。計量資料多組間比較采用 One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較采用Dunnett檢驗，若數據方差不齊則采用Dunnett T3檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠軟骨組織病理學評分比較由表1及圖1可知，Model組組織病理學評分較Control組顯著升高(P<0.05)，提示造模成功。DHJST組組織病理學評分較Model組明顯下降(P<0.05)，提示獨活寄生湯對KOA小鼠具有治療作用。

表1 三組軟骨組織病理學評分比較 (分)

圖1 三組軟骨病理組織學觀察

2.2 三組小鼠軟骨組織Zn2+熒光染色技術檢測結果比較由圖2可知，熒光檢測結果顯示，Model 組較Control 組軟骨細胞內Zn2+含量明顯增加，經獨活寄生湯作用后，Zn2+含量大幅減少，提示獨活寄生湯可明顯降低Zn2+濃度。

圖2 Zn2+熒光染色技術檢測結果

2.3 三組小鼠軟骨組織 RT-qPCR mRNA 表達比較表2顯示，與Control組相比，Model組軟骨組織中ZNT9、MTF1、MMP3、MMP13 mRNA表達增加(P<0.05)，ZIP8 mRNA表達降低(P<0.05)；與Model組相比，DHJST組軟骨組織中ZIP8、ZNT9、MTF1、MMP3、MMP13 mRNA表達降低(P<0.05)。

表2 各組小鼠軟骨組織 RT-qPCR mRNA 相對表達量

2.4 Western blotting蛋白含量比較表3顯示，與Control 組相比，Model組軟骨組織中 ZIP8、MTF1、MMP3、MMP13 蛋白表達增加(P<0.05)，ZNT9蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與 Model 組相比，DHJST 組軟骨組織中 MTF1、MMP3、MMP13 蛋白表達降低(P<0.05)，ZIP8、ZNT9蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 Western blotting 蛋白相對表達量

3 討論

KOA病理特點為關節軟骨損傷退變[10]，研究結果中，Model組小鼠膝關節病理觀察可見，關節軟骨層厚薄不一，關節軟骨嚴重缺損、潮線不完整，大量纖維增生，說明對Model 組小鼠進行DMM后，關節軟骨受損，符合早中期膝骨關節炎的病理表現，DHJST組小鼠膝關節病理表現可見，軟骨層厚薄不一，關節軟骨表層缺損，潮線較整齊，本研究結果中，獨活寄生湯組小鼠軟骨退變程度較Model組減輕，表明獨活寄生湯具有保護KOA模型小鼠軟骨的作用，這與既往研究結果一致[11～13]。

Zn2+在膝骨關節炎疾病中起免疫系統，炎癥和新陳代謝的作用[14]。Zn2+是組成 MMPs 的重要成分，Zn2+是催化 MMP13 活性所必需的金屬離子，同時也是 MMPs 的活化中心[15，16]。 Zn2+與 KOA 發病機理的聯系在其作為基質降解酶的結構成分中得到了廣泛認可。Zn2+在影響骨關節炎疾病時，受 ZIP 和 ZNT 家族的鋅轉運蛋白的控制[17，18]，在人類和小鼠的基因組中，編碼了14個ZIP 和9個 ZNT 轉運蛋白[19]。膝關節軟骨中的Zn2+轉運蛋白ZIP8 蛋白在受到外力創傷、炎癥因子、異常機械壓力等因素的刺激后[4]，其表達水平會異常增高，此時 ZIP8 蛋白會將細胞外的 Zn2+大量轉運到細胞內，Zn2+的涌入會大量激活 MTF1，MMPs和聚蛋白樣金屬蛋白酶會被活化的 MTF1所激活[20]，最終破壞關節軟骨。Song等[21]研究證實miR-488通過抑制ZIP8，進而減少Zn2+涌入細胞內，恢復了II型膠原蛋白的表達水平，減少了MMP-13被激活量，從而保護膝關節軟骨。研究中，Model 組小鼠膝關節軟骨細胞內Zn2+含量明顯增加，說明造模成功后，Zn2+在細胞內大量增加，并參與到膝骨關節炎的發生過程，而經獨活寄生湯作用后，軟骨細胞內Zn2+含量大幅減少，提示獨活寄生湯可抑制Zn2+，隨著 Zn2+的減少，MTF1 表達降低，進而降低MMP3、MMP13表達，減少 MMPs 的被激活量，從而治療KOA，這與前期獨活寄生湯體外實驗研究結果相一致。

鋅離子轉運蛋白ZIP 蛋白和 ZNT蛋白在調節細胞中的Zn2+中發揮重要作用。ZIP 轉運蛋白將Zn2+從細胞外液或細胞內囊泡傳遞到細胞質中，而 ZNT 轉運蛋白則促進Zn2+向細胞外空間移動或將細胞質鋅螯合進入細胞內區室，本研究結果顯示，與 Model 組相比，DHJST 組小鼠膝關節軟骨組織中ZNT9 mRNA表達明顯降低，ZIP8的相對表達量降低顯著。獨活寄生湯對Zn2+轉運蛋白 ZIP8、ZNT9沒有明顯抑制或促進作用，這說明對Zn2+濃度有降低作用，但獨活寄生湯對Zn2+進出軟骨細胞的關鍵環節并沒有明顯影響。