非諾貝特對兔VX2肝癌模型介入術(shù)后肝組織PPAR-α、NF-κB、MMP-9的影響

郭偉蓮，杜偉，李正亮，段文帥

（大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，云南 大理 671000）

0 引言

原發(fā)性肝癌是世界上致死率較高的惡性腫瘤之一，臨床上常用的治療方法是經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈栓塞術(shù)（TAE），對腫瘤的生長具有良好的抑制作用，且全身不良反應(yīng)較少，損傷較小，但其對腫瘤生長的抑制作用主要是通過切斷腫瘤血供實(shí)現(xiàn)的，因此不可避免會(huì)損傷癌旁肝組織，影響肝功能[1,2]。過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPAR-α）屬于核激素受體超家族的成員之一，是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在人體重要的器官尤其是肝細(xì)胞中表達(dá)，可對相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而調(diào)節(jié)肝臟中脂質(zhì)的代謝，降低炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到保護(hù)肝臟的作用[3,4]。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在人體細(xì)胞中廣泛存在，可調(diào)控細(xì)胞增殖、生長、發(fā)育和凋亡等，且在機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中具有重要作用，其下游蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是一種鋅依賴的肽鏈內(nèi)切酶家族，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要的參與作用[5,6]。非諾貝特是PPAR-α激動(dòng)劑，且以往研究證實(shí)非諾貝特對肝臟具有保護(hù)作用[7]。但是非諾貝特對TAE介入術(shù)后肝組織PPAR-α、NF-κB、MMP-9表達(dá)是否有影響尚不清楚，本研究通過建立兔VX2肝癌模型，研究非諾貝特對兔VX2肝癌模型介入術(shù)后肝組織PPAR-α、NFκB、MMP-9的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：30只健康新西蘭兔，2只荷瘤兔，體質(zhì)量在2.5～3.5kg范圍內(nèi)，喂養(yǎng)普通飼料。

藥品及儀器：非諾貝特，硫酸慶大霉素，3%戊巴比妥鈉，生理鹽水，明膠海綿顆粒（350～560μm），超液態(tài)碘化油，碘海醇，培養(yǎng)皿，眼科鑷，眼科剪，18G穿刺針。

1.2 VX2肝癌模型兔建立方法

隨機(jī)取1只荷瘤兔，用3%戊巴比妥鈉進(jìn)行靜脈麻醉，然后將兔固定，將兔后肢腫瘤部位常規(guī)備皮、消毒，然后切開表皮將腫瘤塊剝離，并剔除周圍壞死的組織，取腫瘤塊邊緣活力較好的類似魚肉的腫瘤組織，放入加有裝有提前混合好的50mL生理鹽水和2萬U慶大霉素的培養(yǎng)皿中，將腫瘤塊用眼科鑷剪成碎塊，大小約1～3mm。用注射器抽取1mL上述瘤粒混合液，然后通過18G穿刺針注入健康兔后腿的皮下進(jìn)行傳代。用3%戊巴比妥鈉麻醉兔后固定，備皮、消毒后鋪巾，切開腹部并將肝左葉暴露出來，并用眼科鑷完全拉出肝的左葉，將18G穿刺針傾斜30°刺入肝左葉1.5～2cm，回抽，未見膽汁及血液回流后將1mL瘤粒混合液注入，然后快速用明膠海綿將穿刺的通道填塞住，以防瘤粒脫出來，以確保瘤粒成功種植，然后將腹腔中撒部分慶大霉素，紗布?jí)浩戎寡蠡丶{肝臟，縫合切口，術(shù)后為防止感染，肌內(nèi)注射8萬U慶大霉素，連續(xù)注射三天。

1.3 分組及給藥方案

接種后2周通過CT掃描和MRI掃描觀察造模情況，將建模成功的27只VX2肝癌兔隨機(jī)分為3組，其中對照組：9只，不做任何處理；TAE組：9只，只行TAE術(shù)；聯(lián)合組：9只，行TAE術(shù)，同時(shí)給予非諾貝特。

1.4 考察參數(shù)

（1）肝功能的評價(jià)：分組處理后3天，抽取兔耳緣靜脈血，離心后取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中凝血酶原時(shí)間（PT）、血清清蛋白（ALB）、總膽紅素（TBI）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）含量。

（2）腫瘤生長情況：分別在手術(shù)前一天和術(shù)后28d后，通過B超測定兔腫瘤的最小直徑（b）和最大直徑（a），計(jì)算腫瘤體積，體積計(jì)算公式為：V=1/2ab2，并計(jì)算腫瘤的增長率。

（3）微血管密度的測定：手術(shù)后28d時(shí)，采用免疫組化法測定微血管密度體積：陽性對照：將肝癌陽性標(biāo)本作為陽性對照，陰性對照：以磷酸鹽緩沖液替代一抗。MVD計(jì)數(shù)：CD34因子染血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿陽性時(shí)呈棕黃色，按照Weidner判斷標(biāo)準(zhǔn)，即先在40倍低倍鏡下尋找腫瘤微血管密度最高的5個(gè)區(qū)域，然后在200倍鏡下觀察并計(jì)數(shù)棕黃色的微血管數(shù)目，每一個(gè)不相連的微血管腔及獨(dú)立的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)均作為微血管，被平滑肌細(xì)胞包裹的血管不計(jì)數(shù)，取5個(gè)區(qū)域的平均值作為該兔VX2腫瘤的MVD。

細(xì)胞凋亡檢測：取癌旁肝組織標(biāo)本，采用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行檢測，用TUNEL法對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行評估，細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色或褐色（包括淺褐色和深褐色）表示凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)（AI），即在400倍鏡下隨機(jī)選10個(gè)視野記錄凋亡細(xì)胞占比，然后取10個(gè)視野的平均值。

肝組織過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPAR-α）、NF-κB、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)情況：采用免疫組織化學(xué)染色法測定肝組織PPAR-α、NF-κB、MMP-9的表達(dá)情況，采用Super Vision兩步免疫組化法，步驟如下：切片于60℃烤箱中烤30min，二甲苯Ⅰ液和Ⅱ液各10min，梯度酒精浸泡，3%H2O2孵育10min，蒸餾水洗滌5min，洗滌3次，加入EDTA高壓抗原修復(fù)10min，3%BSA與37℃封閉孵育30min，將多余液體甩去并將適當(dāng)稀釋的一抗按1:2000比例加入40μL，4℃孵育過夜，用PBS沖洗10min，重復(fù)3次，加入二抗，37℃孵育30min，再用PBS洗10min，重復(fù)洗3次，DAB室溫顯色，控制反應(yīng)時(shí)間為5～10min，然后用蒸餾水洗滌，蘇木精負(fù)染，脫水，透明，封片。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：PPAR-α陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，NF-Kb陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，陽性均呈黃色、棕黃色。計(jì)分方法選用Fromowitz每張切片于400倍鏡下隨機(jī)選10個(gè)視野，根據(jù)染色深度及陽性細(xì)胞計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)：0分為<5%，1分為5%～24%，2分為25%～50%，3分為51%～75%，4分為75%以上；染色深度：0分為無著色，1分為淺黃色，2分為黃棕色，3分為棕褐色，將兩者分?jǐn)?shù)相加，加和分?jǐn)?shù)6～7分表示強(qiáng)陽（+++），4～5分表示中等陽（++），2～3分表示弱陽（+），小于2分表示陰性（-）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兔VX2肝癌模型建模成功率

VX2肝癌模型建模成功27只，建模成功率為90%（27/30）。

2.2 肝功能參數(shù)比較

如下表，TAE組肝功能參數(shù)PT、TBI、AST和ALT水平均顯著高于對照組，ALB水平顯著低于對照組（P<0.05）；與TAE組相比，聯(lián)合組肝功能參數(shù)PT、TBI、AST和ALT水平均顯著低于對照組，ALB水平顯著高于對照組（P<0.05），結(jié)果見表1。

表1 肝功能參數(shù)比較（）

表1 肝功能參數(shù)比較（）

注：*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05與TAE組比較。

2.3 腫瘤生長情況比較

手術(shù)前，三組腫瘤體積相當(dāng)（P>0.05），手術(shù)后28d，三組腫瘤體積均顯著增加（P<0.05），聯(lián)合組和TAE組腫瘤體積顯著小于對照組，且聯(lián)合組腫瘤體積顯著小于TAE組（P<0.05），結(jié)果見表2。

表2 各組腫瘤體積（，cm3）

表2 各組腫瘤體積（，cm3）

注：*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05與TAE組比較

2.4 腫瘤增長率比較

聯(lián)合組和TAE組腫瘤體積增長率顯著低于對照組（P<0.05）,且聯(lián)合組腫瘤體積增長率顯著低于TAE組，比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,見表3。

表3 各組腫瘤體積增長率（，%）

表3 各組腫瘤體積增長率（，%）

注：*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05與TAE組比較

2.5 微血管密度比較

與對照組相比，TAE組微血管密度顯著增加（P<0.05）；聯(lián)合組微血管密度與TAE組相比顯著降低（P<0.05），見表4。

表4 術(shù)后28d各組微血管密度比較（）

表4 術(shù)后28d各組微血管密度比較（）

注：*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05與TAE組比較

2.6 細(xì)胞凋亡情況比較

TAE組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組（P<0.05）；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著低于TAE組（P<0.05），見表5。

表5 癌旁肝組織中細(xì)胞凋亡情況比較（）

表5 癌旁肝組織中細(xì)胞凋亡情況比較（）

注：*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05與TAE組比較

2.7 肝組織PPAR-α表達(dá)水平比較

如下表，TAE組肝組織PPAR-α表達(dá)水平比對照組低，聯(lián)合組比TAE組高，聯(lián)合組與TAE組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對照組和聯(lián)合組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表6。

表6 肝組織PPAR-α的表達(dá)水平比較(n,%)

2.8 肝組織NF-Kb的表達(dá)水平比較

如下表，TAE組肝組織NF-κB表達(dá)水平比對照組高，聯(lián)合組比TAE組低，聯(lián)合組與TAE組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對照組與聯(lián)合組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TAE組肝組織NF-κB表達(dá)水平比對照組高，聯(lián)合組比TAE組低，聯(lián)合組與TAE組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對照組與聯(lián)合組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表7。

表7 肝組織NF-κB的表達(dá)水平比較(n,%)

2.9 肝組織MMP-9表達(dá)水平比較

TAE組肝組織MMP-9陽性表達(dá)率為77.78%，顯著高于對照組（11.11%，P<0.05），聯(lián)合組肝組織中MMP-9陽性表達(dá)率為22.22%，顯著低于TAE組（P<0.05），結(jié)果見表8。

表8 肝組織MMP-9的表達(dá)水平比較(n,%)

3 討論

TAE是目前臨床上治療中晚期肝癌的有效方法，但由于肝內(nèi)側(cè)及肝血竇支循環(huán)比較豐富，TAE所用的栓塞劑會(huì)進(jìn)入腫瘤周圍的正常肝組織，并在毛細(xì)血管和微小動(dòng)脈中沉積，引起肝組織缺氧缺血，進(jìn)而引起肝細(xì)胞凋亡、壞死，影響肝功[8]。肝臟含有豐富的酶，例如ALT等用于評價(jià)肝功能參數(shù)的酶，ALT等酶存在于肝細(xì)胞中，肝細(xì)胞受損時(shí)其會(huì)釋放入血，導(dǎo)致血中水平升高，因此可以檢測血清肝功能相關(guān)酶的水平評估肝功能[9]。非諾貝特是PPAR-α激動(dòng)劑，是臨床上常用的降血脂藥物，此外還具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及抗癌等多種生物學(xué)活性，研究發(fā)現(xiàn)其對缺血性肝損傷具有較好的保護(hù)作用[10,11]。本研究結(jié)果顯示TAE組腎功能參數(shù)PT、TBI、AST和ALT水平均顯著高于對照組，ALB水平顯著低于對照組（P<0.05）；與TAE組相比，聯(lián)合組腎功能參數(shù)PT、TBI、AST和ALT水平均顯著低于對照組，ALB水平顯著高于對照組（P<0.05），提示非諾貝特預(yù)處理可顯著降低TEA引起的肝損傷，起到良好的肝保護(hù)作用。

PPAR-α是一種新的固醇類激素受體，屬于Ⅱ型核激素受體家族，PPAR-α在肝、腎、心臟等多種器官中均具有較高的表達(dá)水平，尤其糖異生分解代謝旺盛的器官中，肝臟中糖脂代謝最旺盛，是糖脂代謝的中樞器官，因此PPAR-α在肝臟中表達(dá)水平較高，且主要集中在肝匯管區(qū)域，分布位置主要是線粒體豐富的地方[12,13]。PPAR-α結(jié)合RXR后可對肝細(xì)胞的生理活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，如肝細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、糖原及脂肪酸代謝等，降低炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低肝損傷，且PPAR-α與肝臟疾病如肝缺血再灌注損傷、肝癌、脂肪肝等多種肝疾病都具有密切聯(lián)系[14]。由于肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，腫瘤靶血管增生無法滿足腫瘤細(xì)胞生長需要，因此腫瘤細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)大量壞死，造成PPAR-α表達(dá)水平降低[15]。而PPAR-α激動(dòng)劑非諾貝特可通過上調(diào)肝臟中PPAR-α表達(dá)水平，降低肝臟氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕肝臟損傷[16]。本研究結(jié)果顯示TAE組肝組織PPAR-α表達(dá)水平比對照組低，聯(lián)合組比TAE組高。

TAE栓塞劑進(jìn)入腫瘤周圍的正常肝組織后引起肝組織缺氧缺血，NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在缺血再灌注肝損傷中具有重要作用，NF-κB會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子大量釋放，NF-κB對肝臟缺血再灌注損傷的調(diào)節(jié)具有雙面性，其不僅可以修復(fù)肝組織，同時(shí)也可通過誘發(fā)TNF-α造成肝損傷，缺血再灌注損傷會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而會(huì)激活NF-κB，致使血清中NF-κB水平升高[17]。此外，NF-κB活化后會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，且可通過調(diào)控凋亡基因的表達(dá)造成細(xì)胞惡化[18]。而PPAR-α對NF-κB具有一定的拮抗作用，起到對缺血再灌注及缺血抵抗的作用，降低肝損傷，且有研究顯示非諾貝特對NF-κB的表達(dá)具有抑制作用，從而保護(hù)缺血再灌注造成的肝損傷[7]。本研究中TAE術(shù)后腫瘤旁肝組織中NF-κB表達(dá)水平增加，可能是術(shù)中肝臟細(xì)胞受損，進(jìn)而導(dǎo)致NF-κB表達(dá)水平增加，聯(lián)合組NF-κB表達(dá)水平降低，提示非諾貝特對肝臟缺血外灌注損傷具有較好的保護(hù)作用。

NF-κB是多種信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑的關(guān)鍵點(diǎn)和匯合點(diǎn)，對血管生成相關(guān)因子包括MMP-9的表達(dá)具有調(diào)控和促進(jìn)作用，MMPs的過度表達(dá)會(huì)與腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移具有關(guān)鍵性作用，MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一種，正常生理?xiàng)l件下MMP-9在肝細(xì)胞中的表達(dá)水平較低，但當(dāng)肝細(xì)胞受發(fā)生炎癥反應(yīng)或腫瘤生長時(shí)其表達(dá)水平會(huì)顯著增加，MMP-9水平增加又會(huì)促進(jìn)腫瘤侵襲，形成惡性循環(huán)，加重腫瘤發(fā)展，因此降低MMP-9表達(dá)水平可對肝癌細(xì)胞侵襲和增殖起到抑制作用[19-20]。PPAR-α激動(dòng)劑非諾貝特可上調(diào)PPAR-α表達(dá)水平，PPAR-α可抑制NF-κB的表達(dá)，而NF-κB又可對其下游蛋白MMP-9進(jìn)行調(diào)控，抑制MMP-9的表達(dá)[21]。本研究結(jié)果顯示TAE組肝組織MMP-9陽性表達(dá)率為77.78%，顯著高于對照組（11.11%，P<0.05），聯(lián)合組肝組織中MMP-9陽性表達(dá)率為22.22%，顯著高于TAE組，提示非諾貝特可顯著降低肝癌旁組織中NF-κB表達(dá)水平。

綜上，非諾貝特對兔VX2肝癌模型介入術(shù)后肝損傷具有緩解作用，可以抑制腫瘤生長，可通過抑上調(diào)癌旁肝組織中PPAR-α的表達(dá)，抑制癌旁肝組織中NF-κB和MMP-9的表達(dá)。