鹽酸美金剛干預(yù)對(duì)血管性癡呆大鼠海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)及氧化應(yīng)激水平的影響

孫玉華 許予明 賀維亞

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

血管性癡呆(VD) 是因腦血管病理因素影響腦組織血液循環(huán)，造成腦組織功能減退的認(rèn)知功能缺損綜合征，在我國(guó)較常見(jiàn)，老年患者高發(fā)，疾病發(fā)展呈慢性進(jìn)行性加重過(guò)程。海馬是腦組織的重要功能區(qū)，海馬對(duì)空間學(xué)習(xí)、記憶功能具有重要作用，慢性缺血、長(zhǎng)期腦組織低灌注可損傷海馬區(qū)神經(jīng)元，是VD造成學(xué)習(xí)能力、記憶功能逐漸喪失的病理基礎(chǔ)〔1〕。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，在腦神經(jīng)元細(xì)胞廣泛分布，BDNF對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，分化，生長(zhǎng)具有重要作用，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生指標(biāo)〔2，3〕。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是引起缺血后腦損傷的重要機(jī)制之一，與腦組織氧化還原平衡失調(diào)，激活過(guò)多的活性氧物質(zhì)，使缺血性損傷加重等因素有關(guān)〔4〕。 本研究通過(guò)建立VD大鼠模型，觀察VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及BDNF的表達(dá)水平，分析鹽酸美金剛干預(yù)VD的效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選取12～14月齡的健康雄性Wistar大鼠為研究對(duì)象，體重約為300～400 g，所有大鼠均購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將飼養(yǎng)3 d后無(wú)明顯異常的60只大鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、觀察組，每組各20只。

1.2模型的建立 模型組、觀察組均采用持久雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎方法制作VD大鼠模型。術(shù)前禁水4 h，禁食12 h，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉劑量控制在3 ml/kg，避免麻醉過(guò)深。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)固定模型組、觀察組大鼠，頸前部去毛、消毒，取頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，分別以雙重絲線結(jié)扎，然后逐層管壁切口，術(shù)中維持大鼠肛溫為36.5℃～37.5℃，術(shù)后送動(dòng)物房飼養(yǎng)。對(duì)照組麻醉方法及手術(shù)過(guò)程同上，但不結(jié)扎頸總動(dòng)脈。

1.3研究方法 術(shù)后8 w觀察組給予鹽酸美金剛干預(yù)，連續(xù)4 w。干預(yù)4 w結(jié)束后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。將直徑1.2 m、高20 cm，水溫(23±0.5)℃的水迷宮裝置分成4個(gè)象限，第1象限放置直徑12 cm，高24 cm的透明平臺(tái)，以正西方向的標(biāo)記點(diǎn)為起始，手提大鼠尾部自起始點(diǎn)放入水迷宮，訓(xùn)練并強(qiáng)化大鼠游上平臺(tái)后休息的記憶，記錄3組大鼠找到平臺(tái)的平均時(shí)間。完成水迷宮測(cè)試后將大鼠斷頭取腦，在冰盒上剝離大鼠海馬組織，取1/2海馬組織制作為10%勻漿，離心后取上清液，按試劑盒要求分別采用硫代巴比妥酸、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒測(cè)定SOD、丙二醛(MDA)活性，并測(cè)定SOD、MDA的光密度(OD)值。剩余海馬組織置于4%多聚甲醛中浸泡24 h，HE染色和免疫組化技術(shù)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明，步驟包括乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟后作連續(xù)冠狀切片，厚度約5 μm，采用SP免疫組化法檢測(cè)BDNF，免疫組化試劑盒均由北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供，經(jīng)HE染色后在生物光學(xué)顯微鏡下觀察，采用 HPIAS-1000 病理圖像分析軟件分析圖像評(píng)價(jià)各組大鼠海馬區(qū)BDNF平均灰度值。比較3組大鼠腦皮質(zhì)MDA、SOD，BDNF表達(dá)水平的差異，分析鹽酸美金剛的干預(yù)效果。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠水迷宮試驗(yàn)結(jié)果分析 對(duì)照組水迷宮測(cè)試時(shí)間為(92.8±37.6)s，模型組為(154.6±38.7)s；與對(duì)照組比較，模型組水迷宮測(cè)試時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。觀察組測(cè)試時(shí)間為(117.4±34.2)s，與模型組比較顯著降低(P<0.05)。

2.23組大鼠海馬區(qū)組織形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞均勻、整齊，排列緊密，形態(tài)正常，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量降低，排列無(wú)規(guī)則，細(xì)胞核深染，核仁消失，胞質(zhì)周?chē)锌张荩挥^察組海馬區(qū)形態(tài)學(xué)變化介于對(duì)照組與模型組之間，正常神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組降低，但較模型組密集，排列規(guī)則，大部分胞核為圓形，核仁清晰；小部分細(xì)胞核仁消失，染色質(zhì)減少。

2.33組大鼠海馬區(qū)BDNF平均灰度值以及MDA、SOD光密度值的比較 對(duì)照組可見(jiàn)小部分陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕黃色顆粒染色，BDNF為弱強(qiáng)度表達(dá)。模型組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較少，但殘余神經(jīng)元胞核、胞質(zhì)均有棕黃色染色，BDNF呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；觀察組棕黃色染色神經(jīng)元數(shù)量較模型組增加，BDNF表達(dá)為中等強(qiáng)度。經(jīng)病理圖像分析軟件分析以及SOD、MAO的光密度(OD)值測(cè)定，3組大鼠海馬區(qū)BDNF平均灰度值以及MDA、SOD表達(dá)水平有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠海馬區(qū)BDNF平均灰度值以及MDA、SOD光密度值的比較

3 討 論

BDNF具有內(nèi)源性自我保護(hù)作用，既往研究發(fā)現(xiàn)短暫性或持續(xù)性腦組織缺血均可刺激內(nèi)源性 BDNF 表達(dá)上升，促進(jìn)受損神經(jīng)元細(xì)胞修復(fù)，加速受損傷神經(jīng)元細(xì)胞的分化及再生過(guò)程，并抑制細(xì)胞死亡〔5〕。本次研究中模型組大鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示長(zhǎng)期缺血性損傷可引起海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞上調(diào)BDNF表達(dá)水平，與其他學(xué)者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究相符〔6〕。另外，我們發(fā)現(xiàn)模型組MDA、SOD光密度值與對(duì)照組和觀察組具有顯著差異，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)也是VD引起神經(jīng)元損傷的重要原因。MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，是氧自由基的重要介質(zhì)，可作為評(píng)價(jià)衰老的重要指標(biāo)；SOD是體內(nèi)氧自由基清除酶，MDA、SOD與機(jī)體氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)，可直接反映組織的氧化還原狀態(tài)，MDA、SOD水平可反映自由基損傷程度〔7〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在急性缺血期會(huì)出現(xiàn)MDA水平上升、谷胱甘肽(GSH)活性下降等改變〔8〕。本次研究結(jié)果提示VD大鼠海馬區(qū)存在持續(xù)的自由基損傷，過(guò)量的氧自由基攻擊神經(jīng)元細(xì)胞，并產(chǎn)生不可逆的神經(jīng)元細(xì)胞壞死，自由基損傷可能是慢性腦缺血海馬損傷的重要機(jī)制，但VD引起的長(zhǎng)期氧化損傷的原因尚不清楚，尚需進(jìn)一步研究。

鹽酸美金剛是一種新型的非競(jìng)爭(zhēng)性 NMDA受體拮抗劑，具有低中度親和力以及電壓依賴性特性，是美國(guó)、歐洲首先批準(zhǔn)治療中、重度阿爾茨海默綜合征的藥物，臨床使用安全性較高〔9,10〕。本研究證實(shí)模型組大鼠空間、記憶功能降低與海馬區(qū)結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)，鹽酸美金剛干預(yù)后可降低海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞壞死數(shù)量和程度，保護(hù)其空間記憶功能，與其他學(xué)者研究相符〔11〕。鹽酸美金剛可提高SOD水平，同時(shí)降低MDA活性，在清除海馬區(qū)氧自由基，減輕組織損傷方面具有一定的效果，我們認(rèn)為美金剛對(duì)VD大鼠記憶功能具有保護(hù)作用，該作用機(jī)制與抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)，還可上調(diào)海馬區(qū)BDNF的表達(dá)水平，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)和數(shù)量。

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