環狀RNA circ_0014359在神經膠質瘤中的表達水平及其臨床意義

魏攀，周曉豐，李巖，王婷婷，吳悠悠

神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性顱內腫瘤，其發生于神經外胚層組織，發病率約為8/10萬[1]。目前臨床對膠質瘤的治療方法，主要包括手術治療、放療、化療、免疫治療及光動力學治療等；但由于膠質瘤的惡性程度高、手術切除困難且術后易復發等原因，膠質瘤仍有極高的致殘率和病死率[2-3]。因此，進一步研究膠質瘤的發病機制和新的治療策略，開發新的腫瘤分子標志物和治療靶點具有重要的臨床意義。

環狀RNA(circular RNA,circRNA) 是一類特殊的非編碼RNA分子，最早發現于20世紀70年代，廣泛存在于哺乳動物細胞中，是現今RNA領域的研究熱點[4]。研究表明[5]，與傳統的線性RNA不同，環狀RNA分子呈封閉環狀結構；因此，其不受RNA外切酶的影響，不易被降解。越來越多的研究發現，環狀RNA分子富含多個miRNA結合位點，其可通過與疾病相關聯的miRNA相互作用，可解除miRNA對其靶基因的抑制作用，而發揮重要的調控作用。已有很多文獻報道，環狀RNA分子在多種腫瘤中表達水平異常且其表達與腫瘤的發生發展密切相關。如Wei等研究發現，由Circ_CDYL驅動的非編碼RNA調控網絡在早期肝癌中具有特異性作用[6]；Geng等報道，hsa_circ_0009361作為miR-582的競爭性RNA，可通過調控APC2的表達抑制結直腸癌的進展[7]。此外，環狀RNA分子circ_0007766通過上調細胞周期蛋白D1/CyclinE1/CDK4的表達，促進肺腺癌細胞的增殖[8]。circ_0014359是環狀RNA分子之一，先前的研究表明circ_0014359在膠質瘤組織中表達上調，通過調控miR-153/PI3K信號通路促進膠質瘤的惡變[9]。本研究對聯勤保障部隊第940醫院腫瘤科2012年3月—2015年8月收治的51例神經膠質瘤患者的膠質瘤組織及45例行顱內減壓術患者的正常腦組織的circ_0014359表達水平進行檢測，分析其與膠質瘤患者臨床病理特征及預后的關系。旨在探討circ_0014359在膠質瘤的表達水平及其臨床意義，以及circ_0014359作為膠質瘤診療和預測預后的生物學標記物和潛在治療靶點的可能性，為神經膠質瘤的預防、診斷以及治療提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組51例腦膠質瘤患者中男27例，女24例；年齡35～72歲，平均年齡54.7歲；腫瘤WHO分級Ⅰ級者10例、Ⅱ級13例、Ⅲ級17例、Ⅳ級11例。患者均為首次手術治療，經術后病理檢查證實，術前未接受放療、化療，臨床資料完整。另取45例顱內減壓術患者的正常腦組織為對照組，其中男25例，女20例；年齡27～78歲，平均年齡52.5歲。本研究經醫院倫理委員會同意，患者術前均簽署知情同意書，昏迷患者則由其直系親屬代簽。

1.2 方法

1.2.1 circ_0014359表達水平檢測 手術切除的組織標本在15 min內立即放入-80 ℃液氮中低溫保存，待成批檢測。采用Trizol法(Invitrogen, CA, USA)提取組織標本中的總RNA。然后用NanoDrop 1000分光光度計(NanoDrop,Wilmington,DE,USA)測定其在波長260 nm及280 nm處的吸光度(OD)比值(OD 260/280)，計算RNA濃度并評估純度；選擇OD比值在1.9～2.0范圍內的總RNA作為樣本。用逆轉錄試劑盒將RNA樣品逆轉錄為cDNA，再用實時熒光定量PCR儀檢測膠質瘤和正常腦組織中的circ_0014359表達水平；內參照為GAPDH。然后采用2-ΔΔCt法對檢測數據進行定量分析。所有實驗均重復3次，操作均嚴格按說明書的步驟進行。

1.2.2 臨床病理指標 觀察統計患者的腫瘤直徑、腫瘤位置、是否發生術后復發和淋巴結轉移，以及Kamofsky功能狀態(Kamofsky performance status，KPS)評分和腫瘤WHO級別，WHO分級Ⅰ-Ⅱ 級為低級別膠質瘤，Ⅲ-Ⅳ級為高級別膠質瘤。患者術后隨訪3年，觀察統計患者的生存時間。

2 結 果

2.1 膠質瘤與正常腦組織circ_0014359表達水平比較 膠質瘤組織及正常腦組織circ_0014359表達水平的檢測數據服從正態分布(P=0.721)。膠質瘤組織的circ_0014359表達水平(2.83±0.30)顯著高于正常腦組織(0.97±0.24)，高級別膠質瘤組織的circ_0014359表達水平(3.52±0.30)又明顯高于低級別膠質瘤組織(2.14±0.32)，差異均有統計學意義(P<0.001，P<0.05)。見圖1。

2.2 臨床病理指標與circ_0014359表達的關系 根據本組51例膠質瘤患者的平均circ_0014359表達水平(2.83±0.30)，將患者分為circ_0014359高表達組(23例)和低表達組(28例)。高WHO分級、淋巴結轉移、KPS評分<80分及術后復發與circ_001435高表達有明顯關系(P<0.05～0.005)；而年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑與circ_001435高表達均無明顯關系(均P>0.05)。見表1。

膠質瘤與正常腦組織比較P<0.001；高級別與低級別膠質瘤比較P=0.011圖1 低級別、高級別膠質瘤和正常腦組織的circ_0014359表達水平

表1 臨床病理指標與circ_001435表達的關系(例)

2.3 circ_0014359表達與膠質瘤患者預后的關系 circ_0014359低表達組患者的術后3年生存率顯著高于circ_0014359高表達組患者，差異具有統計學意義(P=0.049 3)。見圖2。

2.4 膠質瘤預后的影響因素 采用單因素分析和多因素Cox比例風險回歸模型對臨床病理指標及circ_0014359表達與生存率進行分析。結果顯示，circ_0014359高表達、高WHO分級、淋巴結轉移、KPS評分低及術后復發是影響腦膠質瘤患者預后的獨立危險因素。見表2。

圖2 circ_0014359高表達組和低表達組患者的術后3年生存率

3 討 論

神經膠質瘤是一種惡性程度極高、極具破壞性的原發性顱內腫瘤，根據2016年WHO中樞神經系統腫瘤分類，神經膠質瘤被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個等級；其中以膠質母細胞瘤的惡性程度最高，患者預后最差，其中位生存時間只有12～15個月[10]。盡管近年來為了改善神經膠質瘤的預后進行了大量的研究；但由于膠質瘤手術切除困難且術后極易復發，膠質瘤患者的預后仍不理想[11]。雖然已經有大量的研究檢測和驗證一些與膠質瘤細胞侵襲和增殖相關的分子；但迄今為止，只有少數分子機制被揭示并轉化為臨床應用。因此，進一步研究膠質瘤的發病機理，探索新的腫瘤標志物和治療靶點成為當前膠質瘤研究的重點。

表2 臨床病理特征和circ_0014359表達與生存率的單因素及多因素分析

circRNA是一種內源性非編碼RNA。越來越多的研究發現，circRNA通過作為miRNA的干擾RNA，與RNA結合蛋白結合、參與翻譯等多種方式在腫瘤的發生發展中發揮多種生物學功能[12]。相關研究表明，由于circRNA缺乏5′帽子結構及3′ poly A尾，導致其表達更加穩定和保守；因此其可能作為腫瘤新的治療靶點在多種腫瘤的治療中起到重要作用[13]。如有研究顯示，hsa_circ_0009361在結直腸癌中低表達，可通過影響miR-582進一步調控APC2的表達從而抑制結直腸癌的進展；hsa_circ_0009361低表達預示患者的預后不良[7]；此外在胃癌中，hsa_circ_0008035可通過靶向miR-375/YBX1軸參與腫瘤的發生發展[14]。Wang等研究發現，環狀RNA VANGL1在非小細胞肺癌中表達水平上調，且通過抑制miR-195和激活Bcl-2促進腫瘤的進展[15]。而膠質瘤中也存在多種circRNA表達異常。Qu等研究顯示，環狀RNA circ_0079593在膠質瘤中通過干擾miR-182和miR-433促進細胞生長和侵襲，高表達的circ_0079593提示預后不良[16]。有文獻報道，circ_0005198在膠質瘤中的表達水平顯著增高，過表達的circ_0005198可調控膠質瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲[17]。Li等研究表明，circ_0001946可通過調控miR-671-5p和CDR1，作為競爭性內源性RNA抑制膠質母細胞瘤的進展[18]。circ_0014359作為一種新發現的circRNA，有研究發現其在膠質瘤組織中表達水平明顯增高，并且作為miR-153的競爭性RNA促進膠質瘤的進展[9]。然而，關于膠質瘤中circ_0014359表達水平的臨床意義尚無文獻報道。為此，本研究通過檢測膠質瘤及正常腦組織的circ_0014359表達水平，探討膠質瘤的circ_0014359表達水平及其臨床意義。

本研究結果顯示，膠質瘤組織的circ_0014359表達水平明顯高于正常腦組織(P<0.001)，且高級別膠質瘤的circ_0014359表達水平明顯高于低級別膠質瘤(P<0.05)，表明circ_0014359表達水平可能與膠質瘤的惡性程度密切相關。circ_0014359高表達與腫瘤高WHO分級、淋巴結轉移、KPS評分低及術后復發有明顯關系(P<0.05～0.005)，而與年齡、性別、腫瘤位置及直徑無關(均P>0.05)。這進一步證實circ_0014359高表達與腫瘤的惡性程度及侵襲性有關，提示可通過抑制circ_0014359在腫瘤細胞中的表達而發揮抑癌作用。此外，生存分析顯示circ_0014359高表達膠質瘤患者的3年生存率顯著低于低表達患者(P<0.05)；單因素分析及多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示，circ_0014359高表達是膠質瘤患者不良預后的獨立危險因素。

綜上所述，circ_0014359在神經膠質瘤組織中表達明顯上調，且其表達水平與膠質瘤的惡性程度密切相關；circ_0014359高表達是預測膠質瘤患者預后不良的重要因素之一，提示circ_0014359可以作為膠質瘤診斷和預測預后的一種潛在的腫瘤分子標志物和治療靶點。盡管目前對circ_0014359在膠質瘤的生物學作用尚不十分明確，但隨著對circ_0014359的作用機制和參與調控信號通路的研究不斷深入，可以為膠質瘤的預防、診斷和治療提供新的思路與方向。