淺談分子生物學(xué)在農(nóng)田土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用

何亦男

摘? ? 要：隨著人們對微生物研究的深入，傳統(tǒng)的農(nóng)田土壤微生物分離培養(yǎng)與鑒定方式逐漸暴露出問題，很難滿足深入了解微生物的生態(tài)學(xué)特性與多樣性的需求。研究農(nóng)田土壤多樣性的過程中應(yīng)用分子生物學(xué)，不僅能獲取農(nóng)田土壤微生物群落的更多相關(guān)信息，還可以解決傳統(tǒng)研究方式無法培養(yǎng)農(nóng)田土壤微生物的問題。闡述了農(nóng)田土壤微生物多樣性的定義，介紹了研究農(nóng)田土壤微生物多樣性的重要意義，對分子生物學(xué)在農(nóng)田土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用進(jìn)行了具體分析，希望為分子生物學(xué)在農(nóng)田土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用提供借鑒。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué);農(nóng)田土壤微生物;多樣性;重要性;應(yīng)用

文章編號： 1005-2690（2021）14-0091-02? ? ? ?中國圖書分類號： S154.3? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

微生物在整個地球物質(zhì)循環(huán)中充當(dāng)著生產(chǎn)者與分解者的角色，是延續(xù)生命的關(guān)鍵。人類對于農(nóng)田土壤微生物多樣性的研究絕大多數(shù)還處于未知狀態(tài)，研究農(nóng)田土壤微生物多樣性可以幫助人類有效開發(fā)微生物資源、改善環(huán)境污染問題、維持生態(tài)服務(wù)功能以及促進(jìn)農(nóng)田土壤可持續(xù)性利用。

人類最初采用平板計(jì)數(shù)法來研究農(nóng)田土壤微生物多樣性，但是這種方式存在一定的問題，比如在研究時會忽略不可培養(yǎng)微生物，使生長速度快、產(chǎn)孢量大的微生物數(shù)量增加等[1]，后來逐漸研究出其他方式幫助人類認(rèn)識農(nóng)田土壤微生物多樣性。目前應(yīng)用比較普遍的是以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的分子技術(shù)，比如核糖體間隔序列分析、核酸分子雜交技術(shù)等。在高通量測序技術(shù)不斷發(fā)展的同時，其在農(nóng)田土壤微生物多樣性領(lǐng)域的運(yùn)用也越來越深入。

1? ?農(nóng)田土壤微生物多樣性的定義

農(nóng)田土壤微生物群落之間在種群與種間上具有差異性，在維持農(nóng)田土壤的質(zhì)量與生態(tài)系統(tǒng)的平衡等方面發(fā)揮著重要作用。

農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定、和諧以及其對微生態(tài)環(huán)境惡化的緩沖能力與農(nóng)田土壤微生物群落的多樣性、結(jié)構(gòu)均勻性緊密相關(guān)。農(nóng)田土壤微生物的多樣性表現(xiàn)為生物在物種、遺傳、結(jié)構(gòu)及功能方面的差異與變化，體現(xiàn)了微生物群落會受到農(nóng)田土壤生態(tài)機(jī)制因素的影響[2]。同時，也可以將農(nóng)田土壤微生物多樣性理解為微生物生命豐富，用農(nóng)田土壤生物區(qū)的變化與生物化學(xué)過程之間的關(guān)系來解釋。

2? ?農(nóng)田土壤微生物多樣性的重要性

隨著人類社會的發(fā)展，土地資源的需求越來越大、破壞也越來越嚴(yán)重，地球生態(tài)系統(tǒng)所提供的資源與其恢復(fù)能力有限。陸地上所有生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)就是農(nóng)田土壤，其最重要的構(gòu)成部分之一是農(nóng)田土壤微生物，能夠幫助農(nóng)田土壤進(jìn)行有機(jī)質(zhì)分解、腐爛、繁殖等生化活動，是促進(jìn)農(nóng)田土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化與養(yǎng)分循環(huán)的關(guān)鍵因素。

除此之外，農(nóng)田土壤微生物是顯示農(nóng)田土壤肥力活性水平的重要指標(biāo)，是儲備養(yǎng)分的“倉庫”，是植物生長所需養(yǎng)分的主要來源，在農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著不可或缺的作用[3]。

植物多樣性與農(nóng)田土壤微生物多樣性之間有緊密的聯(lián)系，植物通過影響農(nóng)田土壤環(huán)境，影響農(nóng)田土壤微生物的多樣性與構(gòu)成，農(nóng)田土壤微生物的多樣性及構(gòu)成代表著對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)能力。重金屬、殺蟲劑這種對植物或動物有害的物質(zhì)，一旦使用劑量超過規(guī)定限度，就會對農(nóng)田土壤微生物多樣性安全產(chǎn)生威脅。在此基礎(chǔ)上，有專家學(xué)者提議利用農(nóng)田土壤微生物與各種污染物之間的反應(yīng)，來幫助確定農(nóng)田土壤污染與制定農(nóng)田土壤環(huán)境容量標(biāo)準(zhǔn)。所以，加強(qiáng)對農(nóng)田土壤微生物多樣性的研究非常重要。

3? ?分子生物學(xué)在農(nóng)田土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用

3.1? ?農(nóng)田土壤微生物 DNA 復(fù)性動力學(xué)分析

研究顯示，微生物多樣性越復(fù)雜，其DNA的同源性就越差，復(fù)性率就越低。所以，可以通過測定群落的DNA同源性與復(fù)性率得到農(nóng)田土壤微生物的群落構(gòu)成和遺傳多樣性。

Torsvik V等研究者利用DNA復(fù)性動力學(xué)分析法對不同程度重金屬污染的農(nóng)田土壤中微生物多樣性的變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，沒有被污染的對照農(nóng)田土壤中有16 000個細(xì)菌基因組，低度重金屬污染的農(nóng)田土壤中含有6 400個細(xì)菌基因組，高度重金屬污染的農(nóng)田土壤中含有2 000個細(xì)菌基因組，通過分析可知，農(nóng)田土壤被重金屬污染的程度越高，微生物多樣性越少[4]。但是需要注意這種方式的分辨率較低，單純使用此方法，只能得到農(nóng)田土壤微生物群落的大致差異，并不能表明其多樣性的變化，想要得到確切的結(jié)果，需要與核酸分子雜交技術(shù)等相結(jié)合。

3.2? ?核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是在20世紀(jì)70年代新出現(xiàn)的一種分子生物學(xué)技術(shù)。以核酸分子堿基互補(bǔ)配對原理為基礎(chǔ)，通過將待測樣品的DNA或RNA與特異性探針雜交形成新分子[5]。

因?yàn)楹怂岱肿与s交技術(shù)具有較高的靈敏性與特異性，從出現(xiàn)后就被廣泛運(yùn)用于研究農(nóng)田土壤微生物的多樣性。RNA基因探針、編碼代謝酶基因探針等都是經(jīng)常應(yīng)用于研究的探針，尤其是近幾年發(fā)展起來的熒光原位雜交技術(shù)，是進(jìn)行不可培養(yǎng)微生物群落多樣性研究的常用方式。

3.3? ?基于PCR的分子生物學(xué)研究技術(shù)

3.3.1? ?變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳（DGGE/

TGGE）

通過使用化學(xué)變性劑或溫度處理DNS雙鏈分子，從而將其分離成序列不同但長度相等的DNA片段，依據(jù)電泳條帶的數(shù)量和位置大概確定農(nóng)田土壤中微生物的類別，粗略分析農(nóng)田土壤微生物多樣性。

DGGE/TGGE技術(shù)可以同時測定不同農(nóng)田土壤中微生物群落的組成與變化情況，具有較高的靈敏性、可重復(fù)性、迅速性，應(yīng)用范圍較廣。但是DGGE/TGGE技術(shù)并不能檢測到所有的微生物多樣性，尤其是很難檢測到劣勢的微生物種群。

3.3.2? ?單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）

堿基的變化會引起單鏈DNA構(gòu)象的變化，不同空間構(gòu)象的單鏈DNA分子在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的帶型也不一樣，以此辨別大小相同但二級結(jié)構(gòu)不同的PCR產(chǎn)物[6]。

SSCP技術(shù)在研究根系微生物、受污染的農(nóng)田土壤微生物等的多樣性方面已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。該技術(shù)比傳統(tǒng)的方式更加節(jié)約時間、節(jié)省成本，降低了誤差，適用于分析微生物群落的組成結(jié)構(gòu)。

3.3.3? ?擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析（ARDRA）

在PCR選擇性擴(kuò)增核糖體DNA片段的基礎(chǔ)上，分析核糖體DNA限制性酶切片段長度的多態(tài)性。此技術(shù)不被菌株是否為純培養(yǎng)所限制，不會受到宿主的干擾，因此，其效率較高、特異性較強(qiáng)，多被運(yùn)用于發(fā)現(xiàn)新物種、鑒定微生物、檢測遺傳性等。

3.3.4? ?隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性方法（RAPD）

RAPD利用隨機(jī)引物，且引物對農(nóng)田土壤微生物群落的DNA沒有特異選擇性[7]。所以，農(nóng)田土壤微生物群落DNA序列組成的差異性，可以通過擴(kuò)增的條帶數(shù)間接反映出來。擴(kuò)增的條帶數(shù)越少，則DNA序列越簡單，充分顯示了農(nóng)田土壤微生物群落序列多樣性的某一側(cè)面，但是并不能展示出群落DNA序列相對多度的信息。

3.3.5? ?擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）

AFLP是基于PCR和RFLP的一種DNA指紋技術(shù)[8]。此技術(shù)集合PCR的高效性與RFLP的可靠性，利用切割兩種以上的酶形成不同酶切位點(diǎn)的限制酶切片段，在其上添加雙鏈人工接頭，并結(jié)合引物與酶切片段識別序列，實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增。此方法可以更好地展示微生物的多樣性，由于AFLP標(biāo)記數(shù)目從理論上來說是沒有限制的，所以具有較好的重復(fù)性[9-11]。

4? ?結(jié)語

分子生物學(xué)技術(shù)在農(nóng)田土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用，為進(jìn)行農(nóng)田土壤領(lǐng)域的研究工作提供了重要的技術(shù)支持與更廣闊的探索空間，因此，將分子生物學(xué)與其他方式相結(jié)合，將推動農(nóng)田土壤微生物多樣性研究工作的發(fā)展。

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