HPV E6/E7 mRNA與HPV-23分型檢測用于宮頸脫落細胞學陽性女性的臨床價值

楊文娟 葉君 陳炎 楊愛平

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全球女性腫瘤第二位，大量研究數(shù)據(jù)顯示近年來宮頸癌發(fā)病呈現(xiàn)年輕化的趨勢[1-2]。高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)感染是導致女性宮頸癌的主要元兇[3-4]。HPV是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是球形DNA病毒，基因組全長7 900 bp，有8個高度重疊的開放讀碼框，由早期基因（early gene，E）、晚期基因（late gene，L）和一個不翻譯的上游調(diào)節(jié)區(qū)3部分組成。早期基因E1～E7分別編碼E1～E7蛋白，其中E6和E7基因能使正常細胞向惡性轉(zhuǎn)化。在HPV致癌作用過程中，病毒DNA融合可引起病毒基因E6和E7調(diào)節(jié)異常[5]。E6和E7蛋白可分別通過黏附腫瘤抑制因子p53和pRB基因使細胞生長抑制基因失活，從而導致細胞癌變。本研究對宮頸薄層液基細胞學檢查（thinprep cytologic test，TCT）陽性患者的宮頸組織采用E6/E7及HPV-23分型檢測，評估其在女性宮頸疾病診治、宮頸癌篩查中的應用價值，為女性健康篩查措施制定、實施提供實驗室理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2017年1月至2018年12月在浙江蕭山醫(yī)院婦科門診的TCT結(jié)果陽性的患者360例，并均行經(jīng)陰道鏡下宮頸組織活檢及病理學檢查。排除近3 d內(nèi)發(fā)生過性關系、妊娠或者哺乳期婦女、有陰道內(nèi)用藥、子宮切除術史、既往有宮頸手術或接受過盆腔放射治療史的患者。根據(jù)病理活檢結(jié)果（病理學分級）分為5組：宮頸癌患者17例，年齡28～74（47.56±14.27）歲；宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅲ級65例，年齡20～83（41.56±11.87）歲；CIN Ⅱ級60例，年齡23～62（39.35±9.55）歲；CIN Ⅰ級95例，年齡22～71（39.81±10.76）歲；慢性宮頸炎患者123例，年齡20～65（39.67±10.41）歲。5組患者年齡差異無統(tǒng)計學意義（F=1.21，P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 TCT檢查及TBS分類 使用TCT檢查的宮頸刷采集子宮頸細胞標本，深入宮頸采集移行帶的宮頸脫落細胞。將已經(jīng)刷取下脫落細胞的宮頸刷放入裝有細胞保存液的小瓶中進行漂洗，使細胞轉(zhuǎn)移到保存液瓶中，并存放于4℃冰箱于2周內(nèi)完成檢測。TBS分類分為未見上皮內(nèi)細胞病變（no intraepithelial lesions were found，NILM）、非典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cell，ASC）、宮頸不典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous epithelial cells of cervix，ASC-H）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（highly squamous intraepithelial lesions，HSIL）。

1.2.2 HPV基因分型檢測（HPV-23分型） 根據(jù)相關試劑盒標本檢測采集要求及實驗室操作規(guī)程采集陰道分泌物，進行17種高危型檢測：HPV 82、73、68、66、59、58、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56；6種低危型：HPV 83、81、6、11、42、43。采用亞能生物技術（深圳）有限公司的試劑盒（批號：Z-TD-0031-04），根據(jù)試劑盒操作說明書（PCR-反向點雜交法）檢測HPV基因型別。所有型別中至少一個結(jié)果出現(xiàn)陽性定為HPV-23分型陽性，全部陰性定為HPV-23分型陰性。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA檢測 采用河南科帝亞生物技術有限公司生產(chǎn)的E6/E7（支鏈DNA信號擴增方法）檢測系統(tǒng)，定性檢測人宮頸上皮脫落細胞中的16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型 別 的HPV E6/E7致癌基因片段信使RNA（mRNA）。不區(qū)分具體型別，采用化學發(fā)光法計算E6/E7的拷貝數(shù)。

1.2.4 宮頸組織活檢及病理分級 在陰道鏡直視下，經(jīng)過醋酸白染色和碘染色，在病變明顯處取組織送病理檢查，病理學分級如下：（1）宮頸不典型增生：輕度不典型增生（CIN Ⅰ級）、中度不典型增生（CIN Ⅱ級）、重度不典型增生（CIN Ⅲ級）；（2）原位癌：癌細胞僅限于上皮內(nèi)，基底膜完整，無間質(zhì)浸潤，屬于CIN Ⅲ級；（3）早期浸潤癌；（4）浸潤癌，包括浸潤性角化型鱗癌、浸潤性非角化型鱗癌，浸潤性小細胞癌。

2 結(jié)果

2.1 不同TBS分類標本E6/E7檢測結(jié)果的比較 不同TBS分類中，ASC-H的E6/E7陽性率最高，為83.33%，LSIL、ASC-H、HSIL的E6/E7陽性率明顯高于NILM、ASC。不同TBS分類E6/E7陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。TBS分級與E6/E7陽性率、E6/E7拷貝數(shù)均呈正相關（r=0.855、0.700，均P＜0.05）。

表1 不同TBS分類標本E6/E7檢測結(jié)果的比較

2.2 不同病理學分級標本的E6/E7、HPV-23分型檢測結(jié)果的比較 不同病理學分級中，NILM、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ、宮頸癌的E6/E7陽性率依次遞增，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但HPV-23分型結(jié)果陽性率差異無統(tǒng)計學意義，見表2。病理學分級與E6/E7陽性率呈正相關（r=0.842，P＜0.05），與HPV-23分型無相關性（r=0.242，P＞0.05）。

表2 不同病理學分級標本E6/E7、HPV-23分型檢測結(jié)果的比較[例（%）]

2.3 不同TBS分類患者HPV-23分型和E6/E7檢測結(jié)果的一致性分析 不同TBS分類中，HPV-23分型和E6/E7檢測結(jié)果完全一致280例，其中兩指標均為陽性250例，兩指標均為陰性30例；結(jié)果不一致80例，其中HPV-23分型陽性/E6/E7陰性75例和HPV-23分型陰性/E6/E7陽性5例，見表3。不同TBS分級HPV-23分型和E6/E7檢測結(jié)果高度一致（Kappa=0.647，P＜0.05）。

表3 不同TBS分類患者HPV-23分型和E6/E7檢測結(jié)果的一致性分析（例）

2.4 不同病理學分級患者HPV-23分型和E6/E7檢測結(jié)果的一致性分析 不同病理學分級中，HPV-23分型和E6/E7檢測結(jié)果完全一致284例，其中兩指標均為陽性268例，兩指標均為陰性23例；結(jié)果不一致69例，其中HPV-23分型陽性/E6/E7陰性58例和HPV-23分型陰性/E6/E7陽性11例，見表4。不同病理學分級HPV基因分型和E6/E7檢測結(jié)果高度一致（Kappa=0.701，P＜0.05），見表4。

表4 不同病理學分級患者HPV-23分型和E6/E7檢測結(jié)果的一致性分析（例）

3 討論

流行病學資料調(diào)查顯示，宮頸癌原位癌高發(fā)年齡為30～35歲，浸潤癌為45～55歲，近年來研究顯示其發(fā)病有年輕化的趨勢[7]。HPV持續(xù)感染可顯著增加宮頸癌發(fā)病的風險，臨床上宮頸刮片、TCT、HPV基因高低危分型篩查的普遍應用，使宮頸癌和癌前病變得以早期發(fā)現(xiàn)和治療，宮頸癌的發(fā)病率和病死率已有明顯下降[8]。本研究結(jié)果顯示，宮頸病變的TBS分類、病理學與HPV E6/E7 mRNA陽性率及其拷貝數(shù)均呈正相關，而與HPV-23分型陽性率無關。也就是說，大多數(shù)女性可有HPV感染史，且大多數(shù)為一過性感染，所以性生活活躍女性且伴有陰道炎體征僅僅HPV-23分型檢測難以識別HPV感染為一過性或是長期感染，而導致假陽性率較高，影響診斷的準確性。隨著TBS分級及病理學分級的加重，E6/E7陽性率及其拷貝數(shù)均明顯升高。大量臨床資料支持E6/E7拷貝數(shù)高的患者，其極有可能為高級別CIN診斷，張生枝等[6]研究結(jié)果也證實，在診斷CIN Ⅱ以上級別的宮頸病變上，E6/E7檢測的特異性和準確性均顯著高于HPV-23分型。E6/E7檢測可排除HPV一過性感染導致假陽性率高的問題，所以TCT檢查聯(lián)合HPV-23分型、E6/E7檢測可為宮頸癌的準確風險評估提供重要依據(jù)，已經(jīng)成為臨床常用的宮頸癌篩查手段[9]。

Kappa一致性分析結(jié)果顯示不同病理學分級及TBS分類患者的HPV-23分型和E6/E7檢測結(jié)果均高度一致（Kappa=0.647、0.701），但也存在部分患者HPV-23分型結(jié)果陽性而E6/E7陰性，說明雖存在HPV感染但未發(fā)生E6/E7基因的復制轉(zhuǎn)錄，該感染可能是一過性的，病情普遍較輕；部分患者HPV-23分型陰性而E6/E7陽性，均出現(xiàn)于病理學與TBS分級較高較重，相關機制有待進一步研究，可能原因如下：首先，HPV-23分型基因變異性較大，突變概率高，不同型別之間交叉變異等導致PCR-反向點雜交法中設計的特異性雜交探針失效；其次，HPV感染目前報道型別很多，而亞能公司提供的試劑盒只能檢測常見的23種型別；再次，型別未涉及，這或許可以解釋DNA陰性而mRNA陽性這一現(xiàn)象。進一步分析顯示，隨著病理學分級及TBS分級病情加重，HPV-23分型與E6/E7同時陽性的比例遠遠高于分級級別較輕者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），董婕等[10]、王靜等[11]也有相似的結(jié)論，針對健康人、CIN Ⅰ～Ⅱ、CIN Ⅲ，HPV DNA陽性率分別為25.6%、90.52%、93.33%、95.38%，E6/E7陽性率為8.5%、43.2%、63.8%、94.6%。HPV的感染與性生活開始年齡、活躍度、性伴侶多少直接相關，隨著宮頸炎病情加重，HPV感染率保持在較高水平，而E6/E7基因的復制趨于活躍度與病情直線相關，所以隨著臨床癥狀的加重，HPV-23分型與E6/E7陽性率一致性越來越高[12]。

綜上所述，E6/E7陽性率和拷貝數(shù)可作為預測宮頸病變的良好指標。定期接受HPV-23分型與E6/E7檢測是女性宮頸癌篩查及發(fā)現(xiàn)宮頸疾病的重要實驗室指標。當然，本研究尚存在許多不足之處：首先，本研究為單中心回顧性統(tǒng)計臨床資料并進行總結(jié)分析，研究對象并不能完全覆蓋整個杭州地區(qū)；其次，HPV感染除了與性生活直接相關外，還受其他因素的影響，如人群易感性和公眾健康措施的不同等；再次，研究周期短，病例數(shù)有限，有待后續(xù)進一步深入的研究。