H型高血壓患者腦卒中危險因素及CACNA1C基因多態性與血清同型半胱氨酸水平的關系研究

晏峰 鐘益芳 任振喚 戴數 周穎 胡云良

有研究發現，我國高血壓人群的同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平明顯增高，這類合并高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）的原發性高血壓被稱為H型高血壓[1]。有研究分析高血壓患者基線Hcy水平后發現，以Hcy≥10μmol/L作為標準，伴有HHcy的高血壓（即H型高血壓）患者比例高達75%～80%[2-3]。相關研究證實H型高血壓也是發生腦卒中的重要原因之一，可使患者發生腦卒中的風險比達11.3，是健康人群的25～30倍[4]，因此認為高血壓和HHcy對腦卒中的發生可能具有協同作用。另有研究顯示L型鈣離子調節通道與原發性高血壓的形成密切相關，鈣離子通道a1c亞基是形成L型鈣離子通道的中心孔蛋白，L型鈣通道亞基基因CACNA1C突變易導致鈣離子通道主要功能喪失，這種功能喪失可能導致高血壓的發生[5-7]，Beitelshees等[8]認為基因CACNA1C多態性與血管內皮細胞抗氧化能力變化有關，影響動脈粥樣斑塊的生成以及高血壓、腦卒中的發生。Yokoyama等[9]認為CACNA1C的rs2299661、rs216008、rs1051375、rs10848683和rs215976位點多態性對血管痙攣、內皮細胞功能有影響。因此，本研究通過測定CACNA1C的rs2299661、rs216008、rs1051375、rs10848683和rs215976位點的多態性，探討H型高血壓患者腦卒中的危險因素及CACNA1C基因多態性與Hcy之間的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年11月至2019年1月麗水市人民醫院收治的高血壓患者1 096例。納入標準：（1）高血壓診斷標準符合中國高血壓防治指南（2018修訂版）[10]；（2）HHcy符合《中國高血壓指防治南2018》中規定Hcy≥15μmol/L，或正在接受降低Hcy治療患者；（3）簽署患者知情同意書。排除標準：（1）3個月內發生過急性心腦血管事件；（2）確診繼發性高血壓；（3）有嚴重精神障礙，無法表達意愿；（4）出現其他明顯異常體征、臨床疾病和實驗室檢查結果，不適合參加研究。根據血清Hcy水平分為H型高血壓組823例（血清Hcy水平≥15μmol/L）和單純高血壓組273例。其中H型高血壓組男486例，女337例，平均年齡（65.12±11.53）歲；單純高血壓組男174例，女99例，平均年齡（62.52±9.42）歲。H型高血壓患者根據是否合并發生腦卒中分為H型高血壓腦卒中組（簡稱腦卒中組）112例和H型高血壓非腦卒中組（簡稱非腦卒中組）711例，腦卒中組男64例，女48例，平均年齡（66.87±10.22）歲，非腦卒中組男422例，女289例，平均年齡（64.52±11.14）歲。腦卒中診斷標準[11]：（1）急性發病的局灶性神經功能缺失，少數可為全面性神經功能缺失；（2）頭顱CT/MRI檢查證實腦部相應梗死灶，或癥狀、體征持續24 h以上，或在24 h內死亡。選擇2019年3至6月本院健康體檢者355例作為對照組，男219例，女136例；平均年齡（61.78±9.88）歲。納入標準：（1）未服藥情況下收縮壓＜140 mmHg，舒張壓＜90 mmHg；（2）排除有心腦血管病或心腦血管病史者以及有腦卒中家族史者。各組對象性別、年齡等一般資料比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經本院醫學倫理委員會審批同意。

1.2 方法 采用問卷調查方式記錄各組對象的性別、年齡、收縮壓、舒張壓、糖尿病、血脂異常、短暫性腦缺血發作（TIA）、房顫、飲酒、吸煙、缺乏鍛煉、心腦血管疾病家族史、BMI等臨床資料。

1.3 觀察指標 采集所有對象的空腹外周血6 ml，其中2 ml加入EDTAK2抗凝管中，于-70℃冰箱冷凍保存，準備抽提DNA。其余4 ml用于測定血脂、TC、TG、HDL-C、LDL-C、脂蛋白（a）[Lp（a）]、Hcy、FPG等水平。H型高血壓組患者根據Hcy水平分為A組608例（Hcy＜20μmol/L），B組147例（Hcy 20～30μmol/L），C組48例（Hcy＞30μmol/L）。

1.4 DNA的提取及分型

1.4.1 DNA的制備 采用細胞裂解和血紅素/蛋白沉淀技術，結合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法提取基因組DNA。

1.4.2 PCR引物合成 PCR引物由SEQUENOM公司軟件Assay Design Design 3.1設計，由北京擎科公司合成，見表1。

表1 5個SN P位點的P CR引物及延伸引物

1.4.3 PCR擴增及單核苷酸多態性（SNP）位點分型 采用多重PCR技術對目的序列進行擴增，完成所選SNP位點基因序列的擴增。將上述擴增產物中加入ddNTP，并通過延伸引物（約20 bp）只能延伸一個堿基的特點，來實現SNP位點的擴增。延伸結束后，通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOFMS）基因分型技術，進行SNP位點分型。

2 結果

2.1 各組對象臨床資料的比較 高血壓各組與對照組比較，在收縮壓、舒張壓、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、飲酒、吸煙、缺乏鍛煉、BMI的差異均無統計學意義（均P＞0.05），而TIA、房顫、心腦血管病家族史、血清Hcy、Lp（a）的差異均有統計學意義（均P＜0.05）；非腦卒中組及腦卒中組與單純高血壓組比較，TIA、房顫、血清Hcy、Lp（a）水平的差異均有統計學意義（均P＜0.05）；腦卒中組TIA、心腦血管病家族史、血清Hcy、Lp（a）均高于非腦卒中組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 各組對象臨床資料的比較

2.2 H型高血壓患者發生腦卒中的危險因素分析 以H型高血壓患者是否出現腦卒中為因變量，以性別、年齡、收縮壓、舒張壓、吸煙、BMI、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Lp（a）、TIA、房顫、飲酒、吸煙、缺乏鍛煉、心腦血管疾病家族史及Hcy為自變量，多因素logistic回歸分析結果顯示：年齡、收縮壓、TIA、房顫、心腦血管病家族史、Lp（a）及血清Hcy水平是H型高血壓患者發生腦卒中的獨立危險因素，見表3。

表3 H型高血壓患者發生腦卒中的危險因素分析

2.3 血清Hcy水平與腦卒中患病率的關系 H型高血壓各組隨著患者血清Hcy水平升高，腦卒中患病率呈增高趨勢，組間兩兩比較差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表4。血清Hcy水平與腦卒中患病率呈正相關（r=0.171，P＜0.01）。

表4 不同血清Hcy水平3組H型高血壓患者腦卒中患病率的比較（例）

2.4 CACNA1C基因多態性分析 高血壓各組和對照組CACNA1C 5個SNP位點基因型分布經χ2檢驗，均P＞0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明4組患者具有群體代表性。

2.4.1 CACNA1C 5個SNP位點基因型峰圖 見圖1-5（峰的部位為多態性位點，單峰表示純合子，雙峰表示雜合子）。

圖1 r s215976分型后3種基因型峰圖（a：C/C型；b：C/T型；c：T/T型）

圖2 r s1051375分型3種基因型峰圖（a：A/A型；b：G/A型；c：G/G型）

圖3 r s2299661分型后3種基因型峰圖（a：C/C型；b：C/G型；c：G/G型）

圖4 r s1084683分型后3種基因型峰圖（a：C/C型；b：C/T型；c：T/T型）

圖5 r s216008分型后3種基因型峰圖（a：T/T型；b：C/T型；c：C/C型）

2.4.2 各組對象CACNA1C的不同位點基因型及等位基因分布頻率的比較 高血壓各組CACNA1C的rs2299661位點的基因型CC頻率均高于對照組（均P＜0.05），腦卒中組與單純高血壓組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；腦卒中組CACNA1C的rs2299661位點的C等位基因頻率高于非腦卒中組、單純高血壓組及對照組（均P＜0.05）；非腦卒中組、單純高血壓組及對照組兩兩比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。rs216008、rs1051375、rs10848683、rs215976各SNP位點基因型頻率及等位基因頻率差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表5、6。

表5 各組對象CACNA1C的不同位點基因型分布頻率的比較[例（%）]

表6 各組對象CACNA1C的不同位點等位基因頻率的比較[例（%）]

2.4.3 rs2299661 C/G不同基因型（CC型、CG型、GG型）攜帶者臨床資料的比較 rs2299661 C/G 3種不同基因型攜帶者之間的年齡、收縮壓、舒張壓、BMI、TIA、房顫、飲酒、吸煙、缺乏鍛煉、心腦血管病家族史、FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），而Lp（a）和Hcy水平差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩兩比較顯示CC型和CG型患者的Lp（a）和Hcy水平明顯高于GG型患者（均P＜0.05），見表7。對腦卒中組患者的rs2299661C等位基因攜帶者（CC+CG基因型）與非攜帶者（GG純合子）的生化參數進行比較，結果顯示兩組血清Lp（a）和Hcy水平差異有統計學意義，C等位基因攜帶者的血清Lp（a）和Hcy水平均明顯高于非攜帶者（均P＜0.05），而年齡、收縮壓、舒張壓、BMI、FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C兩組間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表8。

表7 3種r s2299661C/G不同基因型攜帶者臨床資料的比較

表8 腦卒中組2種r s2299661C/G不同基因型攜帶者臨床資料的比較

3 討論

目前已知的腦卒中危險因素中高血壓為腦卒中首要且獨立的危險因素，且收縮壓每增加10 mmHg，腦卒中發病相對危險增加49%；舒張壓每增加5 mmHg，腦卒中危險增加46%[12]，提示兩者可能擁有共同的遺傳易感基因。我國高血壓人群呈高Hcy水平狀態，H型高血壓約占我國成人高血壓的80%[2-3]。研究顯示中老年人血清Hcy水平與收縮壓、舒張壓或脈壓相關。隨著年齡的增長，脈壓水平和主要終點心血管事件之間呈正相關[19]。Shi等[14]研究發現血清Hcy水平每升高5μmol/L，腦卒中風險將升高59%，缺血性心臟病的風險將增加32%，Hcy每降低3μmol/L，腦卒中風險將下降24%，缺血性心臟病的風險將會降低16%。本研究證實：高血壓患者隨著血清Hcy水平升高，腦卒中患病率呈增高趨勢。有研究顯示，在無腦卒中和心肌梗死的中國成人H型高血壓人群中，降壓和降低Hcy水平可顯著降低首發腦卒中的風險，而對于低葉酸水平的高血壓人群，補充葉酸可顯著降低腦卒中發生的風險[15]。本研究亦顯示H型高血壓組隨著患者血清Hcy水平升高，腦卒中患病率呈增高趨勢，組間兩兩比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；Pearson相關分析結果顯示，血清Hcy水平與腦卒中患病率呈正相關（r=0.171，P＜0.01），因此認為Hcy水平升高與腦卒中的發生存在著密切的聯系[16]。

近年來有關腦卒中候選基因研究較多集中于與血壓調節和高血壓有關的基因。電壓依賴性鈣離子通道L-VDCC[Ca（V）1]為鈣離子通道電壓依賴性鈣通道（voltage dependent Calcium channel，VDCC）的一種類型，為調控鈣離子內流的離子通道，是目前已知選擇性最強的離子通道[17]。研究認為L型鈣離子通道及其相關的多種病理生理現象與高血壓產生有密切聯系[18]，而研究證實L型鈣離子通道α1c亞單位是調節Ca2+進入細胞內的主要通道，因此對人類編碼LTCCα1C亞基的基因CACNA1C研究[19]，對高血壓及腦卒中的防治有著重要的理論和臨床意義。CACNA1C基因位于染色體12p13.3，生成大約6.45 Mb的基因組區段，該基因由至少55個外顯子組成[20]。本研究對CACNA1C基因選取5個SNP（rs216008、rs1051375、rs2299661、rs10848683、rs215976）位點進行測序，包括內含子的61765C/G（rs2299661）、外顯子的558674 C/T（rs216008)、外顯子的628667 C/G（rs10848683）、外顯子的626417 A/G（rs1051375）、外顯子的532175 C/T（rs215976），分析其對H型高血壓和腦卒中的意義。研究結果顯示H型高血壓各組CACNA1C基因rs2299661位點基因型CC頻率均高于對照組（均P＜0.05），腦卒中組與單純高血壓組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），但腦卒中組C等位基因頻率高于非腦卒中組、單純高血壓組及對照組（均P＜0.05）。筆者推斷：（1）腦卒中組與高血壓組之間可能存在著共同的遺傳易感基因；（2）CACNA1C的rs2299661C/G多態性與中國人群H型高血壓腦卒中的發生有關聯。分析推測這種作用機制為：（1）內含子的rs2299661在腦卒中組C/G可能產生基因變異，對鈣通道蛋白mRNA剪接產生影響，進而出現原有的剪接位點消失，新的剪接位點生成；（2）編碼鈣通道氨基酸序列改變，這種改變可能引起鈣離子通道蛋白相關元件的變化，引發鈣離子通道通透性變化；（3）鈣離子內流增加，肌細胞表面的動作電位改變，引起肌細胞的興奮收縮藕聯加強，外周血管阻力增加，出現腦血管的持續痙攣。另發現rs216008、rs1051375、rs10848683、rs215976 SNP位點在H型高血壓組、單純高血壓組與對照組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），說明所選其他CACNA1C基因SNP位點與H型高血壓或腦卒中間并無關聯性。

本研究結果發現，高血壓組CACNA1C基因的rs229966位點CG+CC基因型頻率和C等位基因頻率明顯高于對照組，推測高血壓患者G位點基因剪接為C位點基因，C等位基因增多，G→C替代后，合成表達Lp（a）與Hcy的轉錄因子活性增強，可能促使Lp（a）與Hcy血清水平表達增加，而兩者水平的表達升高可造成動脈粥樣硬化斑塊的形成、遷移、崩解、破碎，引發腦卒中發生，進一步引起腦卒中后繼發性腦損傷、神經元凋亡等[21]，參數比較結果也顯示兩組Lp（a）和Hcy水平差異有統計學意義，C等位基因攜帶者的Lp（a）和Hcy水平明顯高于非攜帶者（P＜0.05），因此也證實高水平Lp（a）與Hcy與腦卒中發生呈正相關[22]，因此提示CACNA1C基因rs2299661位點C/G多態性可能與H型高血壓腦卒中發生有關聯，但Lp（a）與Hcy間如何相互作用，對H型高血壓腦卒中的影響仍需繼續研究。

綜上所述，腦卒中是多基因、多因素疾病，是遺傳和環境因素互相作用所致，本研究亦證實Hcy水平升高與腦卒中的發生存在著密切聯系，CACNA1C基因rs2299661位點C/G多態性可能與H型高血壓腦卒中發生有關聯，C等位基因可能為H型高血壓腦卒中的易感位點。