支鏈氨基酸對奶牛體外胰腺消化酶分泌的影響及其交互作用

徐 明，馬 軒，王夢雅,2，吳東霖，邵 凱，李 茹(.內蒙古農業大學 動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 0008；2.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 7200)

泌乳前期奶牛由于能量攝入無法滿足代謝需求，常處于能量負平衡狀態，對機體健康和生產性能產生一定負面影響。淀粉是高產反芻動物重要的能量來源，但飼喂大量淀粉會誘發瘤胃酸中毒等代謝性疾病[1-2]。研究表明，反芻動物小腸降解淀粉的能量利用率比在瘤胃中發酵高42%[3-4]。但小腸消化淀粉的能力有限，胰腺α-淀粉酶分泌不足是限制小腸淀粉利用的關鍵因素[4-5]。因此，改善胰腺外分泌功能對提高反芻動物小腸淀粉的消化、滿足能量需求、維持機體健康具有重要意義。

Swanson等[6]發現，增加日糧蛋白質含量可提高安格斯育肥牛胰腺α-淀粉酶的分泌，這與蛋白質中的氨基酸組成有關。支鏈氨基酸(BCAAs)包括亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val)，這些氨基酸不能在動物體內合成，只能通過飼糧獲取。BCAAs是蛋白質合成的底物，還具有調節能量分配、葡萄糖代謝以及激素分泌等多種生物學功能[7-9]。前期試驗表明，十二指腸灌注亮氨酸可以增加關中青年山羊和荷斯坦青年牛胰腺消化酶的分泌[10-11]。研究發現，適當提高纈氨酸濃度可以提高草魚淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的分泌[12]。目前對3種BCAAs影響胰腺外分泌功能的具體劑量效應及其交互作用尚無報道。

鑒于此，本試驗通過體外組織培養的方法，研究BCAAs對荷斯坦奶牛胰腺消化酶分泌的影響及其交互作用，旨在為提高小腸淀粉利用效率、減少飼料資源浪費提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

1.1.1 試驗1 BCAAs濃度對奶牛胰腺消化酶分泌的影響 將5頭荷斯坦奶牛于呼和浩特北亞清真肉食品有限責任公司屠宰后，取出胰腺，用4 ℃的生理鹽水沖洗，并置于4 ℃的鹽水中迅速轉移至實驗室。將組織置于冰上進行組織剝離，切成2×2 mm的小塊組織(約0.1 g)，用濾紙吸干，并用玻璃皿稱重。培養組織方法與Swanson等[13]方法相同。將組織塊放入分別含有0、2.62、5.24和10.48 mg/mL亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的Krebs Ringer bicarbonate buffer(KRB)溶液中進行組織塊培養，每個處理5個重復，于39 ℃水浴搖床中培養，振蕩頻率90次/ min，培養60 min。將所有培養液的pH調至7.4。

1.1.2 試驗2 3種BCAAs對奶牛胰腺消化酶分泌的交互影響 將5頭荷斯坦奶牛屠宰后，收集胰腺組織，其處理方法與試驗1相同。采用2×2×2的3因素、2梯度試驗設計，3種BCAAs濃度分別為0和5.24 mg/mL，共8個處理，每個處理5個重復。培養方法同試驗1。

1.2 樣品收集與分析

培養結束后，取出培養板置于冰上。用移液槍從每個培養孔中吸取700 μL KRB培養液置于帶標記的無菌無酶凍存管中，-20 ℃保存。將組織單獨取出在鹽水中勻漿，儲存于凍存管中標記，于-20 ℃冰箱保存。

于1周內用試劑盒(南京建成生物工程研究所)分析消化酶的活性。酶活性以活性單位表示，1個單位定義為39 ℃下每分鐘釋放1 μmol產物。

組織釋放(IU/g)=(KRB培養液(mL)×酶活性(IU/mL))/組織重量(g)

1.3 統計分析

通過SAS 9.2 的一般線性模型程序分析消化酶活性數據。試驗1使用單因素方差分析(ANOVA)分析培養時間內BCAAs對胰腺消化酶參數的影響；試驗2利用Duncan法對組均值之間的顯著性進行多重比較及交互作用分析。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 預試驗

預試驗表明，組織培養時間為60、120和180 min時，α-淀粉酶的總活性隨時間增加而增加，但單位時間(每小時)釋放的α-淀粉酶活性隨時間增加而下降(結果未顯示)。因此，選擇60 min為培養時間。

2.2 BCAAs濃度對奶牛胰腺消化酶分泌的影響

2.2.1 亮氨酸濃度對胰腺消化酶分泌的影響 不同濃度亮氨酸處理后，奶牛體外胰腺消化酶活性測定結果見表1。從表1可見，隨著亮氨酸濃度的升高，胰腺組織中α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性和組織釋放α-淀粉酶的活性隨亮氨酸濃度提高呈二次曲線變化(P<0.01)，且在5.24 mg/mL時達到最高值。與對照組(0 mg/mL)相比，亮氨酸線性增加了組織釋放胰蛋白酶的活性(P<0.05)，但沒有增加糜蛋白酶的活性(P>0.05)。

表1 亮氨酸濃度對奶牛體外胰腺消化酶活性的影響Table 1 Effects of Leu concentration on enzyme activity of bovine pancreas in vitro

2.2.2 異亮氨酸濃度對胰腺消化酶分泌的影響 不同濃度異亮氨酸處理后，奶牛體外胰腺消化酶活性測定結果見表2。從表2可見，高濃度異亮氨酸(5.24和10.48 mg/mL)線性增加了組織中糜蛋白酶活性(P<0.05)和組織釋放α-淀粉酶的活性(P<0.01)。與對照組相比，異亮氨酸不影響組織中α-淀粉酶和胰蛋白酶分泌，也不影響組織釋放胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(P>0.05)。

表2 異亮氨酸濃度對奶牛體外胰腺消化酶活性的影響Table 2 Effects of Ile concentration on enzyme activity of bovine pancreas in vitro

2.2.3 纈氨酸濃度對胰腺消化酶分泌的影響 不同濃度纈氨酸處理后，奶牛體外胰腺消化酶活性測定結果見表3。從表3可見，隨著纈氨酸濃度的增加，組織中和組織釋放的α-淀粉酶的活性呈二次曲線變化(P=0.05)，且在濃度為5.24 mg/mL時達到最高值；纈氨酸不影響胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(P>0.05)。

表3 纈氨酸濃度對奶牛體外胰腺消化酶活性的影響Table 3 Effects of Val concentration on enzyme activity of bovine pancreas in vitro

2.3 3種BCAAs對奶牛胰腺消化酶分泌的交互影響

不同濃度亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸對奶牛體外胰腺消化酶活性的交互作用見表4。從表4可見，亮氨酸和纈氨酸顯著增加了組織中和組織釋放α-淀粉酶的活性(P<0.05)，極顯著降低了脂肪酶的活性(P<0.01);亮氨酸顯著增加了組織中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(P<0.05);異亮氨酸顯著增加了組織中糜蛋白酶的活性(P<0.01)，對α-淀粉酶，胰蛋白酶和脂肪酶的活性沒有影響(P>0.05);組織釋放胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性不受3種BCAAs的影響(P>0.05)，且3種BCAAs之間沒有交互作用(P>0.05)。

表4 支鏈氨基酸對體外胰腺消化酶的交互作用Table 4 Interaction of BCAAs on pancreatic enzyme activity in vitro

3 討 論

隨著奶牛生產性能的增加，更有效地滿足奶牛的營養需求是目前面臨的巨大挑戰。一般在生產中給奶牛供應高淀粉型日糧以滿足奶牛的能量需求，但會引起瘤胃酸中毒，并導致過多的淀粉進入小腸。越來越多的研究表明，胰腺消化酶分泌量不足限制小腸中淀粉的消化[4-5]。因此，需要確定營養因子是否影響胰腺消化酶的產生和分泌。增加肉牛小腸酪蛋白供應量可增加動物胰腺重量和胰腺總α-淀粉酶分泌[13，15]。

Swanson等[6,16]發現，增加牛日糧蛋白質含量或真胃灌注酪蛋白中可增加其胰腺α-淀粉酶的活性。蛋白質中某些氨基酸的含量會對胰腺α-淀粉酶分泌產生影響[17-18]。

BCAAs是動物體內無法合成的必需氨基酸，對動物的生長和發育起著重要作用。亮氨酸不僅是哺乳動物的必需氨基酸之一，而且還是蛋白質合成的底物，它作為有效的營養因子，在蛋白質合成和組織代謝中起著重要的調節作用[19]。

BCAAs尤其是亮氨酸可以通過mTOR信號通路在翻譯水平影響胰腺消化酶的活性[20]，也可以改變基因的表達，從而在轉錄水平上調節其活性。當豬口服或注射亮氨酸時，其胰腺、心臟、肝臟和骨骼肌等組織中的蛋白質合成會增加[21-22]。已有研究報道，亮氨酸可通過mTOR信號傳導途徑刺激奶牛乳蛋白合成[23-25]。

本研究主要的目的是通過體外組織培養的方法，系統研究BCAAs影響荷斯坦奶牛胰腺消化酶分泌的劑量規律，以及3種BCAAs之間是否存在交互作用。

課題組前期研究已經證明，十二指腸灌注亮氨酸可提高山羊胰腺分泌的及小腸食糜的胰蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶的活性[10,14]。楊昕澗[26]研究表明，牛奶中添加亮氨酸能夠提高奶公犢小腸胰腺α-淀粉酶的活性。此外也有報道，添加過量的亮氨酸不再增加α-淀粉酶分泌量[10,14,26]。本試驗表明，當培養液中亮氨酸濃度升高時，胰腺α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶分泌量呈先升高、后降低的趨勢，當亮氨酸濃度為5.24 mg/mL時，酶分泌量達到最高值。這與前述試驗結果一致。

異亮氨酸與亮氨酸結構相似，也是蛋白質合成的底物，生物學功能相近。本試驗表明，當培養液中異亮氨酸濃度升高時，胰腺α-淀粉酶和糜蛋白酶分泌量呈先升高、后降低的趨勢，當BCAAs濃度為5.24 mg/mL時，酶分泌量達到最高值，異亮氨酸對胰蛋白酶濃度沒有影響。Richert等[27]研究表明，增加日糧中異亮氨酸含量會增加泌乳母豬乳汁中的干物質、蛋白質和脂肪含量，并增加幼年建鯉腸、肝、胰腺的消化酶活性[28]。Liu等[29]報道，隨著異亮氨酸的小腸灌注量增加，奶牛胰腺α-淀粉酶和胰蛋白酶的活性呈線性增加。異亮氨酸可顯著增加奶山羊胰腺組織和培養液中α-淀粉酶的釋放速率[30]、胰腺組織糜蛋白酶和胰蛋白酶的總濃度[31]。這與本試驗一致。

本試驗結果表明，組織釋放的α-淀粉酶活性隨著纈氨酸濃度呈二次曲線變化，當纈氨酸濃度為5.24 mg/mL時達到最高值，纈氨酸不影響糜蛋白酶和胰蛋白酶釋放量。Attaix等[32]研究表明，纈氨酸不影響羔羊體內蛋白質的合成。這與本試驗纈氨酸不影響蛋白酶分泌量相符。

目前，三種BCAAs對反芻動物胰腺消化酶分泌的交互影響方面的結果尚未見報道。本研究發現，三種BCAAs對α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的影響均沒有交互作用。亮氨酸顯著增加了胰腺α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的活性，與前述結果一致。三種BCAAs對脂肪酶活性存在顯著的交互作用。亮氨酸顯著降低了脂肪酶活性，此方面未見類似報道，有待進一步深入研究。

4 結 論

本研究證實，隨培養液中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸濃度提高，體外胰腺組織α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶分泌量呈先升高、后降低的趨勢，分別均在5.24 mg/mL時達到最高值。3種BCAAs對α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌量沒有交互影響。亮氨酸和纈氨酸降低胰腺組織脂肪酶分泌量，3種BCAAs之間存在交互影響。