牦牛瘤胃和腸道微生物多樣性及影響因素研究進展

信金偉,姬秋梅*(1.省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏 拉薩 850000； 2.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，西藏 拉薩 850009)

牦牛(Bosgrunniens)是中國青藏高原的特有牛種，為當地人民提供肉、乳、皮毛和燃料等生產生活資料，在高原生態系統中扮演著重要角色，具有重要的社會、生態和經濟價值[1]。為適應高原上低溫、低氧和強紫外線輻射的惡劣環境，牦牛進化出了獨特的適應機制以獲得更高的植物纖維素利用率。因低溫、高海拔、溫差大和降水不均等特點[2-3]，青藏高原的植被以天然高寒草甸為主，草甸每年4月返青，8月達到生物量巔峰，11月枯萎，牧草資源匱乏。與低海拔地區的黃牛相比，牦牛的氮排泄量相對較低，對攝入氮的利用效率更高[4]；在相同飼養條件下，牦牛的氮保留量比本地黃牛更高，表明牦牛能更有效的吸收和利用氮元素，是其適應青藏高原嚴酷環境的重要機制之一[5]。

瘤胃是反芻動物特有的消化器官，主要功能是降解纖維素，可幫助牦牛適應高原貧瘠的草原環境[4，6]。瘤胃中含有大量的細菌、真菌、古菌和原蟲，各種微生物協同發酵植物飼料，分解成宿主能利用的短鏈脂肪酸和蛋白[2]。為了提高牦牛的纖維素消化率和飼料利用率，有必要對瘤胃微生物的組成和功能作深入了解[7-9]。腸道是微生物共生的另一重要器官，是動物體吸收消化營養物質的主要場所。腸道微生物近十年來被報道與多種疾病相關，如炎癥性腸病、肥胖、代謝綜合征、腸癌、糖尿病、阿爾茲海默癥、抑郁癥等[10-16]，已成為共生微生物的研究熱點和重點。腸道菌群可產生多樣的小分子代謝產物(短鏈脂肪酸等)，通過腸道神經系統和外周循環系統直接或間接參與并調控宿主的物質代謝、免疫反應，并構建黏膜屏障抵御病原微生物的入侵[17-20]。鑒于瘤胃腸道微生物對維持瘤胃腸道環境的穩定以及宿主健康起著至關重要的作用，深入了解牦牛瘤胃和腸道微生物組成及其變化規律，對提高牦牛的生存能力、個體健康和生產效率具有重要意義。

1 牦牛瘤胃和腸道微生物多樣性

牦牛消化和代謝與其他反芻動物具有很大的差異，能夠更加高效的降解纖維素，同時排出更少的甲烷。相關研究表明，瘤胃和腸道菌群穩態對牦牛的正常生長、代謝和營養轉化效率具有重要作用。牦牛瘤胃內部的細菌(1011～1012CFU/mL)、古菌(107～109CFU/mL)、真菌(104～106CFU/mL)和原蟲(103～105CFU/mL)，在穩態情況下緊密協作消化植物纖維，為宿主提供能量[21]。其中，細菌是瘤胃和腸道的主要微生物，亦是本文探討的重點。由于99%的微生物不可培養[22-23]，伴隨高通量測序技術和環境基因組分析技術的發展，越來越多的瘤胃和腸道微生物在非可培養技術層面得以研究[24-28]，并取得了一定進展。

1.1 牦牛瘤胃細菌多樣性

瘤胃在反芻動物消化方面具有重要作用，目前關于牦牛胃腸道共生微生物的研究主要集中在瘤胃菌群方面。由于生存環境、飼養方式和攝入營養源的差異，不同品種的反芻動物會產生不同種類或數量的瘤胃菌群。An等[29](2005年)采用16S rRNA基因克隆文庫構建的同源分析法，研究了牦牛與晉南牛(Bostaurus)的瘤胃微生物多樣性差異，結果表明，牦牛瘤胃細菌以低G+C含量的革蘭氏陽性細菌(LGCGPB, 54.12%)和擬桿菌門(Bacteroidetes, 30.93%)為主，晉南牛瘤胃細菌主要由擬桿菌門(39.59%)、γ-變形菌門(γ-Proteobacteria,26.9%)和LGCGPB(22.34%)組成；同時，在牦牛瘤胃中檢測到的10.8%序列與已知瘤胃纖維分解菌屬有關，而在晉南牛瘤胃中則有4%和17.8%的序列與纖維分解類和淀粉分解類微生物有關。鑒于相關研究可知，因獨特的生存環境和青藏高原短暫的牧草期，牦牛為高效轉化植物纖維并儲存能量，其瘤胃微生物進化富集了更多關于纖維分解的菌群。因此，研究牦牛瘤胃微生物組成、功能和相關適應機制，對畜牧業的推進具有重要作用。

隨著測序技術的發展，關于牦牛瘤胃微生物多樣性的研究開始興起，越來越多的新物種和功能被發現。Kim等[30](2011年)發現厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為反芻動物瘤胃細菌的絕對優勢門類； Henderson等[31](2015年)在屬的水平上發現擬桿菌門中的普氏菌屬(Prevotella)為反芻動物瘤胃中的絕對優勢菌屬，具有分解蛋白的作用。Guo等[32](2015年)采用16S rRNA基因高通量測序，將操作分類單元(OTUs)擴大至7200個，對6頭四川甘孜的成年雄性牦牛瘤胃的樣品進行了分析，為該地區相關研究提供了更全面的數據；該研究共鑒定出40個OTU屬于古菌(0.56%)、6 642個OTUs屬于細菌、518個OTU為新的未鑒定原核生物，共23門和159科，其中擬桿菌門(39.68%)和厚壁菌門(45.9%)為優勢門。Xue等[9](2016年)結合16S rRNA基因文庫構建，發現牦牛瘤胃原核生物隸屬于29門、40綱、63目、77科和79屬，其中97.7%為細菌，優勢種群為擬桿菌門(59.1%)、厚壁菌門、變形菌門和纖維桿菌門；優勢菌屬為普氏菌屬，占牦牛瘤胃原核生物屬中的28.5%，低于該屬在奶牛中的比例(50%以上)。普氏菌屬被報道均有廣泛生物學功能，在日糧蛋白的初步分解和半纖維素的高效利用具有重要作用，因此研究普氏菌屬對牦牛飼料利用的作用，可對該菌屬和其代謝產物進行益生菌、益生元的開發，有望進一步提高牦牛的飼料利用率。

另外，牦牛相較其他反芻動物有更少的甲烷排放量，這個現象也在牦牛瘤胃微生物多樣性中得到了驗證[33]。反芻動物瘤胃除了將飼料分解成短鏈脂肪酸外，還產生H2和CO2，這些副產物的不斷累積會對植物纖維的利用產生反饋抑制效應。為了提高纖維利用率以抵御嚴寒缺草的時節，牦牛瘤胃富集了更多的產甲烷菌，利用CO2和H2合成甲烷(CH4)，同時有其他機制再利用甲烷降低其排放[34]。Xue等[9](2016年)的研究通過產甲烷古菌特異性序列mcrA基因構建克隆文庫研究牦牛瘤胃古菌多樣性，發現古菌占原核菌群的2.26%，其中甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae, 82%)、甲烷熱球菌科(Methanomassiliicoccaceae)和甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae)為優勢種群，甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)為優勢菌屬。張學燕等[35](2018年)對牦牛瘤胃固液相(瘤胃食糜和瘤胃液)進行了甲烷菌多樣性分析，發現甲烷短桿菌屬(63%)為古菌中的優勢屬。這些結果提示，甲烷短桿菌屬對牦牛甲烷的合成和排放量具有重要作用，值得進行可培養菌群的研究，為探索反芻動物甲烷減排機制和提高飼料能量利用率提供參考。

1.2 牦牛腸道細菌多樣性

動物腸道是宿主動物從食物資源中獲取營養物質和水分的主要部位，共生著數量龐大、種類繁多的原核微生物。腸道菌群目前被報道參與調節宿主的多個代謝途徑，菌群穩態與失衡對免疫炎癥、腫瘤、肥胖、糖尿病、抑郁癥的發展和調節等具有重要作用[36-37]。目前，關于牦牛腸道微生物多樣性的研究仍處于起步階段。Nie等[38](2017年)采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)和宏基因組測序技術研究了牦牛結腸微生物群落結構，超過85%的rRNA基因序列屬于厚壁菌門和擬桿菌門；基因功能分類顯示，大多數編碼酶基因與纖維素消化和氨基酸代謝途徑有關。尚立強等[39](2019年)發現高海拔地區雙峰駱駝、綿羊和白牦牛的糞便微生物在門水平上具有一致性，優勢群體主要是擬桿菌門、厚壁菌門、纖維桿菌門、變形菌門、螺旋體門(Spirochaetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和廣古菌門；而擬桿菌屬、Alistipes、普氏菌屬和纖維桿菌屬為3種動物腸道微生物優勢屬。Zhang等[40](2019年)對牦牛腸道微生物詳細劃分后進行了16S rRNA高通量測序，結果顯示，門水平上從十二指腸到盲腸的優勢菌群呈現均一性，依次為厚壁菌門、擬桿菌門和變形桿菌門，但各菌群的相對豐度存在顯著差異。

基于目前研究結果，牦牛腸道內微生物群落以厚壁菌門、擬桿菌門和變形桿菌門為主，與人類和其它哺乳動物的腸道微生物菌群相似[41-42]。厚壁菌門和擬桿菌門主要負責碳水化合物和蛋白質的消化[43]；而變形桿菌門具有高度多樣化的代謝功能，在高海拔寒冷的環境下有利于牦牛對高能量和營養的需求[43]。瘤胃菌科常見于反芻動物瘤胃和后腸，能夠降解纖維素和淀粉。但與其它反芻動物不同的是，牦牛腸道內還存在Romboutsia、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)[40]，這說明牦牛腸道微生物為適應高原環境演化出了獨特的菌群多樣性。這些研究結果表明牦牛腸道菌群種類豐富且不同腸道部位各具多樣性特征和對應的功能，因此對牦牛腸道菌群進行深入研究，能夠幫助我們了解腸道菌群和瘤胃菌群的關系以及對宿主的影響。

2 牦牛瘤胃和腸道微生物群落結構的影響因素

飼料成分、生存環境和年齡等因素都會影響反芻動物瘤胃腸道微生物菌群結構[44]。了解各因素對牦牛瘤胃和腸道菌群的影響，可為牦牛營養調控、改善環境適應力和免疫調節等提供理論指導。因此，深入了解日糧與微生物組成之間的相互作用，可以調節牦牛瘤胃腸道功能，提高免疫力，改善飼料的使用、提高生產效率和生長性能。

2.1 飼料成分

劉開朗等[45](2009年)對魯西肉牛、荷斯坦牛、晉南牛、牦牛、黃牛和Hanwoo 6個品種牛進行了瘤胃微生物分析，結果表明宿主品種以及對應品種的飼養方式是影響瘤胃細菌群落結構組成的重要因素。牦牛的主要飼料和飼養方式依賴于青藏高原，其草場主要為高寒草甸型，牧草生長時間短，枯草期長，牧草飼用價值受季節變化影響很大。因而牦牛瘤胃腸道微生物群落會相應的隨著飼料成分發生季節性變化。Ma等[46](2019年)研究了返青期、青草期和枯草期對牦牛瘤胃微生物群的影響,返青期牧草粗蛋白含量最高(13.22%)，而枯草期牧草中性洗滌纖維含量最高(59%)，因而返青期牦牛瘤胃微生物多樣性和豐度最高。馬力等[47](2019年)發現，牦牛瘤胃液氨態氮、乙酸、異丁酸、丁酸、總揮發性脂肪酸含量均在青草期最高，厚壁菌門豐度顯著高于返青期和枯草期，然而瘤胃微生物整體多樣性及豐度卻最低；擬桿菌門、厚壁菌門和普氏菌屬的相對豐度在3個物候期均較高；在種水平上，瘤胃微生物以纖維素降解菌為主。

由于高原草甸的營養成分變化(粗蛋白、短鏈脂肪酸及纖維)，目前較為成熟和常用的飼料補充方式是添加控釋尿素作為氮源補充，有提高蛋白質利用率、穩定瘤胃環境和節約飼料的作用[48]。Yan等[49]研究了高低兩種控釋尿素水平對牦牛瘤胃微生物的影響。其結果表明，所有牦牛的瘤胃微生物以擬桿菌門(63.2%)、厚壁菌門(24%)和變形桿菌門(5.63%)為主，主要真菌類群為復膜孢酵母屬(Saccharomycopsis，22.44%)、念珠菌屬(Candida，5.26%)和Pseudopithomyces(3.32%)；飼喂低控釋尿素水平組牦牛日平均增重和飼料利用率優于高水平組牦牛；分析微生物多樣性差異發現，控釋尿素添加顯著降低了瘤胃中綠菌門(Chlorobi)、理研菌屬、畢赤酵母屬(Pichia)、地霉屬(Geotrichum)和明梭孢屬(Monographella)的豐度。由此可見，控釋尿素可影響牦牛瘤胃微生物多樣性和群落組成，這些差異富集的菌群對調整飼料有重要作用。

另外，隨著畜牧業向規模化、集約化發展，部分地區牦牛的飼養方式已從天然放牧轉為半舍飼和舍飼，牦牛瘤胃腸道微生物群落結構也會發生相應的變化[50]。曹連賓等[51](2016年)采用16S rRNA高通量測序技術分析了不同飼養方式下牦牛瘤胃細菌多樣性，發現放牧牦牛的瘤胃厚壁菌門比例比舍飼牦牛高(79.52% vs 62.79%)，擬桿菌門比例低(19.27% vs 25.58%)；纖維降解菌豐度差別不大；但舍飼牦牛瘤胃內的蛋白降解菌和淀粉降解菌比放牧牦牛更豐富，提示人為干預飼料成分，如添加氮源等能夠改變瘤胃菌群。Zhou等[52](2017年)研究了天然放牧、放牧+補飼和舍飼3種飼養方式對牦牛瘤胃微生物的影響。在門水平上，3種飼養方式的牦牛瘤胃細菌均以擬桿菌門(51.06%)和厚壁菌門(32.73%)為主；在屬水平上，放牧組和放牧+補飼組的普氏菌屬的相對豐度高于舍飼組，而放牧組的瘤胃球菌屬(Ruminococcus)相對豐度則低于放牧+補飼組和舍飼組。整體上，不同飼養條件下牦牛瘤胃細菌群落結構不同，而古細菌群落結構基本相同。Xue等[6](2017年)采用舍飼和放牧兩種方式飼養藏羊和牦牛,研究發現，兩種飼養方式下4組間厚壁菌門、纖維桿菌門、變形菌門、螺旋體門和TM7存在顯著差異；舍飼牦牛組變形桿菌門和纖維桿菌門的豐度最高，厚壁菌門豐度最低；放牧組的甲烷球形菌屬(Methanosphaera)和Shuttleworthia的豐度顯著高于舍飼組，且甲烷微球菌屬(Methanimicrococcus)只存在于放牧組；而舍飼組的Succiniclasticum、YRC22和Moryella的豐度則顯著高于放牧組。

以上結果表明，牦牛瘤胃微生物群落組成與飼料成分存在顯著相關性，雖然不同飼料情況瘤胃主要優勢菌門相同，但種屬水平上利用不同營養的功能菌群在發生變化，適應特定的飼料成分和食源環境。這些變化的菌群將是研究的重點，如篩選富集植物利用率高、甲烷排放量小的牦牛個體中區別于其他個體的優勢功能菌屬作為益生菌；或采用代謝組學分析得到功能菌屬的短鏈脂肪酸等作為益生元添加到飼料中，對調節瘤胃腸道功能和減少甲烷排放等方面具有至關重要的作用。然而目前缺乏飼料成分與牦牛腸道微生物的相關研究，忽視了腸道微生物在牦牛營養攝取和吸收的作用，加快這方面的研究能夠完善對牦牛共生微生物的消化作用認識，增強相關飼養水平。

2.2 年齡

年齡也是造成牦牛瘤胃/腸道微生差異的因素之一。Nie等[38](2017年)比較了0.5歲、1.5歲和2.5歲牦牛結腸微生物組成，發現年齡對三者腸道微生物組成有顯著影響，尤其是0.5歲與1.5歲牦牛之間，厚壁菌門、擬桿菌門、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、軟壁菌門(Tenericutes)和藍藻(Cyanobacteria)的相對豐度差異更大。Wang等[53](2017年)的研究表明，老年牦牛(10.7±0.6歲)瘤胃中甲烷桿菌綱(Methanobacteria)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷桿菌科和甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)的豐度明顯高于成年牦牛(5.3±0.6歲)。聶召龍等[54](2019年)比較了幼年牦牛(1歲)和成年牦牛(4歲)的瘤胃微生物多樣性，在屬水平上，普氏菌屬和瘤胃球菌屬在幼年牦牛瘤胃內的相對豐度均高于成年牦牛(4.69% vs 2.68%，4.69% vs 1.79%)。

可見，牦牛瘤胃腸道微生物群會隨著年齡的變化而改變。幼牛在成長的過程中，可能會因為食源由高消化率的牛奶轉變為低消化率的草，導致負責蛋白質降解的菌群減少，而負責降解纖維素的菌群則增加[38]，乃至成年時其瘤胃腸道微生物形成穩定的生態系統。當牦牛衰老，則可能由于器官衰老等原因導致攝食量低于壯年牦牛，進而導致了瘤胃腸道菌群的差異化[53]。目前，關于年齡與牦牛瘤胃腸道微生物菌群的研究仍然有限，穩定的菌群對宿主的健康至關重要。探索不同年齡下牦牛瘤胃腸道微生物優勢菌群的組成結構，一方面有利于了解瘤胃腸道微生物的穩態機制，另一方面可為不同年齡牦牛瘤胃腸道微生物的長期調控奠定基礎。

2.3 性別

大量研究表明，人類和嚙齒類動物腸道菌群多樣性與性別有關。有報道稱人體微生物受性激素調節，青春期后女性腸道微生物多樣性明顯高于男性。然而性別對反芻動物瘤胃和腸道微生物多樣性的影響鮮有報道。韓雪平等[55](2020年)通過16S rRNA基因測序和Tax4Fun功能分析，成年公牦牛瘤胃微生物多樣性指數Sobs高于母牦牛，尤其是與植物纖維降解相關的微生物豐度差異明顯，包括普氏菌屬在公牦牛中豐度更高。但目前尚不清楚性別如何影響牦牛的胃腸道微生物多樣性。母牦牛的營養狀況與犢牛初生重和成活率具有重要作用，因此未來對性別影響進行深入研究，有助于按照性別不同對牦牛進行精準飼養，指導添加不同益生菌、益生元或飼料調整。

2.4 疾病

腹瀉是牦牛最常見的疾病之一，嚴重影響牦牛的生長發育，會影響其生殖力、產奶量和體重，尤其是圍產期牦牛在發生腹瀉后，胎兒會因營養不良和脫水而死亡[56]。牦牛腸道菌群紊亂和失衡會引發腹瀉。Han等[57](2017年)研究了腹瀉對圍產期牦牛腸道糞便菌群數量和結構的影響，發現腹瀉組牦牛腸道菌群在門、綱、目、科、屬水平上的群落組成則存在顯著差異。Li等[58](2018年)比較了3頭健康成年公牦牛、3頭腹瀉成年公牦牛和3頭腹瀉牦犢牛的糞便樣本；在門水平上，健康牦牛與腹瀉牦牛新麗鞭毛菌門(Neocallimastigomycota)相對豐度存在顯著差異；在屬水平上，健康成年牦牛與腹瀉成年牦牛有23個屬存在顯著差異，健康成年牦牛與腹瀉犢牛有28個屬存在顯著差異，而腹瀉成年牦牛則與腹瀉犢牛有23個屬存在統計學差異。了解牦牛病理期瘤胃腸道菌群變化，找到與疾病密切相關的菌群，有利于牦牛疫病防治，增加犢牛存活率，避免因犢牛死亡引起的重大經濟損失。

綜上所述，牦牛瘤胃腸道微生物的群落組成受到飼料、飼養方式、年齡以及健康狀況的影響。干凈衛生、營養均衡的飼料有利于穩定牦牛瘤胃腸道菌群；枯草期飼料中補飼及增加氮攝入有助于牦牛的生長。牦犢牛常因為腹瀉而死亡，為提高牛犢存活率，牦牛瘤胃和腸道內菌群與疾病之間關系的研究仍需加強。牦牛瘤胃腸道微生物組成復雜多變，在飼養牦牛的過程中需綜合考慮各潛在因素對牦牛的影響。

3 展 望

共生于反芻動物胃腸道中的微生物組與宿主形成穩定的互利互惠關系，其穩態與宿主的正常生長和健康息息相關。隨著生物技術的快速發展，胃腸道微生物組與宿主之間的相互關系和調控機制被逐漸揭示，但反芻動物胃腸道微生物組尤其是腸道微生物的組成和功能尚不明確。對牦牛瘤胃腸道微生物群及其功能的定位、區分特定微生物的生態位、確定種群多樣性、并探索微生物組與宿主之間的關系，將是今后牦牛瘤胃腸道菌群研究的主要方向。鑒于此，加強飼料成分、飼養方式和年齡等因素對瘤胃腸道微生物群落系統發育和功能的深入研究，找到對牦牛飼喂具有重要意義的差異富集微生物、對應功能和對應代謝產物，通過添加益生菌、益生元等食源干預的方法來調控瘤胃微生物群落將是提高飼喂水平的有效策略。同時，了解健康或疾病下微生物與宿主的交互作用，可避免動物抗生素的使用，降低微生物的耐藥性，減少環境污染，并為牦牛疾病的早期檢測、防疫和治療提供依據。最后，了解牦牛胃腸道微生物組成與功能，對牦牛養殖向高產化、高效化和高質化發展，推進畜牧業牦牛養殖的發展，對促進牦牛系列產品開發并滿足人民需求，具有重要意義。