伊拉肉兔和美系獺兔FGF5基因外顯子及部分內含子多態性研究

牛華鋒，張成東，楊雪嬌，任戰軍，王淑輝，趙永攀(.楊凌職業技術學院 動物工程分院，陜西 楊凌，700；. 西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌，7000； . 陜西省畜牧產業試驗示范中心，陜西 涇陽770)

兔毛生長發育過程與毛囊(毛乳頭)關系密切[1]。成纖維細胞生長因子5(Fibroblast growth factor 5，FGF5)是唯一通過影響毛囊生長期的長短而影響被毛長度的調控因子[2]。因此，研究該基因的序列結構和遺傳分布對家兔被毛性狀的選育具有重要意義。FGF廣泛存在于各組織中，迄今為止共鑒定包括FGF5在內的23種FGFs。Hebert等[3]1994年利用基因打靶技術，通過胚胎干細胞基因敲除證實go基因就是FGF5基因。Sundberg等[4]進一步揭示，FGF5基因大約2 kb核苷酸的缺失導致安哥拉鼠軀干被毛過度增長。Mulsant等[5]于2003年擴增出兔FGF5外顯子Ⅰ和Ⅲ，發現外顯子Ⅰ存在一個TCT插入突變，外顯子Ⅲ存在T-C錯義突變。夏勝榮等[6]采用PCR-RFLP法 對5個家兔群體FGF5基因部分外顯子1的遺傳多樣性分析發現外顯子1的220～222位點存在TCT缺失。馮凱等[7]分析了5個家兔品種FGF5 CDS區序列，發現外顯子Ⅰ285～287位點存在TCT缺失，外顯子Ⅲ存在T-C突變，但是沒有得到外顯子Ⅲ的基因型條帶。李春笑等[8]采用PCR產物直接測序法檢測滎經長毛兔、天府黑兔以及加利福尼亞兔，發現FGF5外顯子Ⅰ的217位點存在TCT插入突變，檢測出2種基因型，FGF5外顯子Ⅲ的59位點和3位點存在T-C錯義突變和T-C同義突變。由此可見，對家兔FGF5基因的多態性研究還不盡完善，不同兔品種間FGF5基因多態性存在差異，有必要對更多的兔品種進行多態性研究，為家兔分子育種提供更多的理論依據。

伊拉肉兔是法國歐洲兔業公司在20世紀70年代末由9個原始品種經不同雜交組合選育而成，具有生長發育快、出肉率高、肉質鮮嫩，但被毛品質差。美系獺兔是從美國引進，被毛品質好，粗毛率低，被毛密度大，制裘價值很高。本試驗旨在研究伊拉肉兔和美系獺兔FGF5基因外顯子Ⅰ、外顯子Ⅱ和外顯子Ⅲ的單核苷酸多態性，尋找有價值的多態位點以及突變位點，探索與毛質性狀有關的遺傳標記，為家兔分子選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在陜西天鑫食品有限公司選擇伊拉肉兔和美系獺兔各70只(公母各35只)，心臟采血10 mL放入已添加2.5 mL滅菌ACD抗凝劑的離心管中，用冰盒迅速帶回實驗室，-80 ℃保存。采用酚-氯仿法提取基因組DNA，-20 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 參考http://asia.ensembl.org/ 基因庫中兔FGF5基因外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ序列，用oligo 6設計引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 FGF5基因外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的引物序列信息Table 1 Primer sequence information of FGF5 ExonⅠ, Ⅱ and Ⅲ

1.2.2 PCR擴增條件 PCR體系為50 μL ： 2×Taq Master Mix來自康威世紀，由Taq DNA polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、藍色染料以及PCR穩定劑和增強劑組成，共25 μL；上游和下游引物各2 μL(濃度為10 pmol/μL)，DNA模板1μL(濃度為100 ng/μL)，dd H2O 20 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，FGF5基因 ExonⅠ、Ⅱ和Ⅲ的退火分別為60 ℃、56.5 ℃、 55 ℃，均為40 s，72 ℃延伸40 s，34個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用BIO-RAD凝膠成像系統檢測擴增結果。

1.2.3 PCR產物測序 各樣本均取30 μL擴增產物和20 μL上下游引物，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化、反向測序。

1.2.4 數據統計 采用MegAlign、Chromas Application 2.3.0.0軟件對測序結果進行序列結構分析，通過序列比對和序列峰值校正，篩選出SNP位點，判斷突變位點的基因型。用PopGene32軟件進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，計算基因型頻率、等位基因頻率、雜合度、有效等位基因數等遺傳參數，用PIC軟件計算多態信息含量。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

FGF5外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，產物特異性良好，片段長度符合預期。

圖1 FGF5 外顯子Ⅰ(A)、Ⅱ(B)和Ⅲ(C) PCR產物電泳檢測結果 M. D2000標準分子量；1～5. FGF5外顯子ⅠPCR產物；6～10. FGF5外顯子ⅡPCR產物；11～15. FGF5外顯子ⅢPCR產物Fig.1 Electrophoresis results of FGF5 Exon Ⅰ (A) ,Ⅱ (B) and Ⅲ (C) PCR amplification products M. D2000 DNA ladder；1～5. products of FGF5 Exon Ⅰ; 6～10. products of FGF5 Exon Ⅱ;11～15. products of FGF5 Exon Ⅲ

2.2 PCR產物測序結果

將家兔FGF5外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的PCR產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化、雙向測序。結果顯示FGF5外顯子Ⅰ和Ⅲ均存在多態性，FGF5外顯子Ⅱ不存在多態性。

2.2.1FGF5外顯子Ⅰ 測序結果發現，在FGF5外顯子Ⅰ的168～169位點間(記作FGF5外顯子ⅠA位點)存在AGA 3堿基插入突變，將該位點存在AGA插入的等位基因命名為A1,不存在AGA插入的等位基因命名為A2，共發現3種基因型：基因型A1A1(突變型)為引物169～171位點存在AGA 3堿基插入(反向)；基因型A2A2(野生型)為 169位點不存在AGA 3堿基插入(反向)；基因型A1A2(雜合子)為 169位點等位基因存在AGA 3堿基插入造成測序結果產生移碼突變(反向)(見圖2)。

圖2 FGF5外顯子Ⅰ的3種基因型Fig.2 Three genotypes of FGF5 Exon I

2.2.2FGF5外顯子ⅡFGF5外顯子Ⅱ的測序結果顯示，外顯子Ⅱ全部序列(104 bp)以及內含子Ⅰ的7 686～7 852 bp和內含子Ⅱ的1～218 bp片段未發現多態位點(圖3)。

圖3 外顯子Ⅱ基因序列(反向)Fig.3 Exon II gene sequence(Reverse)

2.2.3FGF5外顯子ⅢFGF5外顯子Ⅲ的135位點(記作FGF5外顯子ⅢB位點)存在C-G 單堿基突變，將含C堿基的等位基因命名為B1，含G堿基的等位基因命名為B2，共檢測出2種基因型，分別為B1B1和B1B2，見圖4。

圖4 FGF5外顯子Ⅲ 兩種基因型Fig.4 Two genotypes of FGF5 Exon Ⅲ

2.3 遺傳多態性分析

由表2可知，在所檢測的伊拉肉兔和美系獺兔群體中，FGF5外顯子ⅠA位點均存在3種基因型，在伊拉肉兔中A2A2基因型頻率明顯高于A1A1和A1A2基因型頻率，A2A2基因型為優勢基因型；A2等位基因頻率明顯高于A1等位基因頻率，等位基因A2為優勢等位基因。在美系獺兔中A1A1基因型頻率明顯高于A1A2和A2A2基因型頻率，A1A1基因型為優勢基因型；A1等位基因頻率明顯高于A2等位基因頻率，等位基因A1為優勢等位基因。FGF5外顯子ⅠA位點基因型頻率在伊拉肉兔群體中分布不符合hardy-weinberg平衡定律(P<0.05)，在美系獺兔群體中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

表2 FGF5外顯子Ⅰ不同基因型在伊拉肉兔和美系獺兔中的遺傳分布Table 2 Genetic distribution of FGF5 Exon I genotypes in Ira meat rabbit and American Rex rabbit

由表3可知，在所檢測的伊拉肉兔和美系獺兔群體中，FGF5外顯子ⅢB位點都只存在B1B1和B1B2兩種基因型，且基因型B1B1的頻率分別為0.6429和0.8857均明顯高于B1B2基因型頻率，基因型B1B1為優勢基因型；B1等位基因頻率明顯高于B2等位基因頻率，等位基因B1為優勢基因。FGF5外顯子ⅢB位點基因型頻率在伊拉肉兔和美系獺兔群體中分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

表3 FGF5外顯子Ⅲ不同基因型在伊拉肉兔和美系獺兔中的遺傳分布Table 3 Genetic distribution of FGF5 exon Ⅲ genotypes in Ira meat rabbit and Amercian Rex rabbit

雜合度和多態信息含量是衡量群體等位基因片段多態性的重要參數，雜合度和多態信息含量越低，表明基因突變變異程度越低，遺傳一致性越高。由表4可知，伊拉肉兔和美系獺兔FGF5外顯子Ⅲ的B位點觀測雜合度，期望雜合度和有效基因數均較低，而它們FGF5外顯子Ⅰ的A位點這些指標相對較高。在伊拉肉兔和美系獺兔FGF5外顯子Ⅰ的A位點以及伊拉肉兔FGF5外顯子Ⅲ的B位點均存在中度多態(0.25

表4 伊拉肉兔和美系獺兔FGF5基因各多態位點的遺傳參數Table 4 Genetic parameters of FGF5 gene polymorphisms in Ira meat rabbit and American Rex rabbit

3 討 論

本試驗采用PCR產物直接測序法，對伊拉肉兔和美系獺兔兩個品種進行基因多態性分析，與PCR-SSCP法和PCR-RFLP法相比，不僅簡化了試驗操作，而且提高了對PCR產物突變位點的檢測精度，PCR產物直接測序法尋找突變位點的準確率達到了100%。

伊拉肉兔和美系獺兔是目前我國飼養量較多的家兔品種，美系獺兔毛絨品質優良，被毛品質好，粗毛率低，被毛密度較大，皮板富有彈性；伊拉肉兔被毛品質與美系獺兔差異較大，因此，本研究選擇這2個品種分析研究其毛絨品質相關分子遺傳標記。本研究發現在伊拉肉兔和美系獺兔2群體中FGF5基因外顯子Ⅰ和Ⅲ均存在多態性，FGF5外顯子Ⅱ不存在多態性。在FGF5外顯子Ⅰ中存在1個TCT插入突變，與Mulsant等[5]和李春笑等[8]的研究結果一致，但是各基因型在不同兔品種間的分布有所不同，本研究結果顯示A1等位基因為美系獺兔的優勢基因，A2等位基因為伊拉肉兔的優勢基因，而馮凱等[7]發現A1等位基因為閩西南兔、海貍色獺兔、白色獺兔、九疑山兔和皖江長毛兔的優勢基因，皖系長毛兔群體中未發現A2等位基因；李春笑等[8]研究顯示A1等位基因在滎經長毛兔中占絕對優勢，A2等位基因在天府黑、加利福尼亞兔中占絕對優勢。劉琳玲等[9]研究發現FGF5基因T376C位點為水貂毛長性狀的主控位點。FGF5在哺乳動物毛發生長過程中具備關鍵性的調節作用，FGF5基因外顯子Ⅰ發現的A1等位基因和A2等位基因在伊拉肉兔和美系獺兔的差異性與品種選育有關，美系獺兔在培育的過程中絨毛品質是關鍵性狀，以皮用為主，伊拉肉兔在培育過程中肉用性能為關鍵性狀，兼顧絨毛品質。由此可以證明FGF5外顯子ⅠA位點A1等位基因決定了家兔的長毛的表型，是影響被毛生長的重要因子，對家兔品種培育及絨毛資源利用都具有極高的應用價值。

FGF5基因是多態信息含量是衡量等位基因片段多態性的理想指標，是衡量基因突變變異程度高低的指標[10]， 本研究伊拉肉兔和美系獺兔FGF5外顯子Ⅰ的A位點以及伊拉肉兔外顯子Ⅲ的B位點多態信息含量0.25

FGF5外顯子ⅢB位點基因型頻率在伊拉肉兔和美系獺兔群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)。FGF5外顯子ⅠA位點基因型頻率在美系獺兔群體中也處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)，而在在伊拉肉兔群體中處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(P<0.05)。高愛琴[11]研究發現FGF5外顯子SNP位點 在 內 蒙古絨山羊、遼寧絨山羊品的基因頻率處于Hardy-Weinberg不平衡狀態，而在文登奶山羊群體處于Hardy-Weinberg 平衡狀態。李新海等[12]研究內蒙古絨山羊在該位點基因頻率均處于Hardy-Weinberg平衡狀態。美系獺兔在FGF5外顯子ⅠA位點和外顯子ⅢB位點基因頻率處于平衡狀態的原因說明其群體在品種選育、遺傳漂變等作用下，這些位點基因均處于動態平衡中。造成伊拉肉兔FGF5外顯子ⅠA位點基因頻率不平衡的原因可能與其對經濟性狀的選擇、樣本數量等因素有關，其對毛絨品質的調控還需進一步的研究和探索。

本研究發現FGF5外顯子Ⅲ引物的135位點存在G-C的突變，但未發現馮凱等[7]、李春笑等[8]、Mulsant等[5]所發現的T-C錯義突變。對于突變是否影響以及如何影響家兔的產毛性能還需要進一步的研究。

4 結 論

家兔作為一種重要的皮用經濟動物，毛絨品質至關重要，為了提高其生產性能，本研究對伊拉肉兔和美系獺兔2品種FGF5基因外顯子及部分內含子多態性研究發現在伊拉肉兔和美系獺兔2群體中FGF5基因外顯子Ⅰ和Ⅲ均存在多態性，FGF5外顯子Ⅱ不存在多態性；FGF5外顯子ⅠA位點A1等位基因為美系獺兔的優勢基因，A2等位基因為伊拉肉兔的優勢基因。由此推斷FGF5可以作為調控家兔毛絨品質的候選基因，FGF5外顯子ⅠA位點A1等位基因是影響被毛生長的重要因子，對家兔品種培育及絨毛資源利用都具有極高的應用價值。