馬身豬CD63基因CDS區(qū)的克隆、表達及生物信息學分析

張雪蓮，晉大鵬，劉 敏，吳怡琦，李文霞，秦本源， 蔡春波，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，山西 太谷 030801；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

抗原分化簇63(cluster of differentiation 63, CD63)作為最具有特征性的血小板活化分子標志物[1]，被發(fā)現(xiàn)于激活的血小板表面，命名為血小板糖蛋白40(platelet glycoprotein 40, Plt Gp40)[2]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，CD63是存在于人早期黑色素瘤細胞中的黑色素瘤抗原491(ME491)[3]，還與溶酶體相關的膜表面糖蛋白3(lysosome-associated membrane glycoprotein 3, LAMP3)是同一種分子[4]。CD63作為四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF)成員，包含4個跨膜域與2個胞外域，具有相似的結構和功能。

CD63與細胞活化、黏附、變異、炎癥反應、人免疫缺陷病毒(HIV)、生殖系統(tǒng)及腫瘤的侵襲、轉移等多種生命過程相關[5-6]。CD63作為嗜堿性粒細胞的活化標志，廣泛表達于活化的嗜堿性粒細胞膜表面；此外在其他活化細胞表面也有表達，包括血小板、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和組織肥大細胞等[7]。Miyamoto等[8]發(fā)現(xiàn)，在活化的小鼠巨噬細胞中，CD63 mRNA表達顯著增加。CD63作為活化血小板表面的抗體，可介導血小板的活化過程，內(nèi)皮細胞與中心粒細胞結合后，參與炎癥反應及腫瘤轉移等病理過程[9-10]。此外CD63在免疫應答方面也發(fā)揮了重要作用，在巨噬細胞(APC)和樹突狀細胞(DC)中，CD63可通過內(nèi)體途徑伴隨主要組織相容性復合體II(Major Histocompatibility Complex II, MHC-II)分子呈遞抗原并啟動免疫應答，即CD63可以與細胞表面的MHC-II相互作用，形成的CD63-MHC-II類復合物重新分布在細胞表面以呈遞給CD4陽性T細胞從而促進免疫應答的發(fā)生[11-12]，并起到保護膜蛋白免于降解的作用[13-14]；CD63通過協(xié)調(diào)核內(nèi)體和自噬過程以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)潛伏期膜蛋白1(Latent membrane protein 1, LMP1)水平[15]。而當細胞受到病原菌刺激活化后，CD63從反面高爾基網(wǎng)(trans Golginetwork, TGN)轉運至細胞表面，或者直接通過細胞內(nèi)途徑轉運至內(nèi)體和溶酶體，參與多種生理過程。劉艷杰等[16]研究表明,CD63在免疫應答和病原菌侵襲中發(fā)揮重要作用，這為進一步研究豬免疫應答分子調(diào)控網(wǎng)絡提供了一定的理論基礎。

馬身豬是山西省地方豬種，具有產(chǎn)仔多、耐粗飼、繁殖力高、抗逆性強、肌內(nèi)脂肪含量高、肉質(zhì)品質(zhì)好等優(yōu)點。近幾年關于馬身豬的研究多集中在肉質(zhì)[17-18]和脂肪沉積[19]方面，而對馬身豬免疫方面的研究相對較少。此外CD63基因的研究主要集中在人、小鼠等試驗動物上，有關豬CD63基因的研究未見報道。因此，本試驗對馬身豬CD63進行克隆及生物信息學分析，以期為進一步研究豬CD63生物學功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

本研究所用試驗動物為90日齡山西省地方豬種馬身豬3頭，均為公豬，28日齡斷奶時去勢，由山西省大同市種豬場提供。達目標日齡當天屠宰，屠宰后，分別取馬身豬的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腰大肌、背部皮下脂肪等樣品，放入已標記的凍存管中，迅速置于液氮中保存。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 Green Taq Mix(Vazyme，南京)；DL1 000 DNA Marker、RNAiso Plus regent、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex Taq II等購于大連TaKaRa。

1.2.2 主要儀器 AB-9902 PCR儀(AB，美國)；Universal Hood II 核酸蛋白成像儀(Bio-Rad，美國)；ND-1000核酸蛋白測定儀(Nanodrop，美國)；DYY-3電泳儀(六一儀器廠，北京)；ABI 7500實時熒光定量PCR儀(ABI，美國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取和cDNA合成 采用TaKaRa RNAiso Plus試劑盒提取各組織的總RNA，提取方法參照試劑盒說明書。將提取的總RNA用核酸蛋白測定儀測定其純度及濃度，OD260/OD280在1.8～2.0范圍內(nèi)的總RNA用于后續(xù)研究。采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設計與合成 根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中預測的豬CD63基因mRNA序列(登錄號：XM_005663878.2)，用NCBI Primer-BLAST和Oligo7軟件分段設計擴增CD63基因CDS區(qū)的引物P1及P2，并設計熒光定量引物P3及內(nèi)參基因18S rRNA的引物(表1)，送上海生工股份有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.3CD63基因CDS區(qū)的擴增及克隆 以馬身豬所有組織的混合cDNA作為模版，擴增豬CD63基因CDS區(qū)。PCR反應總體積為20 μL：Green Taq Mix 10 μL，cDNA 2 μL，P1或P2上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O補至20 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，選擇擴增效果好的PCR產(chǎn)物送華大基因公司測序。

1.3.4 不同組織CD63基因表達特性分析 以18S rRNA為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR技術對馬身豬各組織CD63的表達譜進行分析。qRT-PCR反應總體積為20 μL：上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.3 μL，cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq II 10 μL，RNAase Free ddH2O補至20 μL。反應程序參照SYBR Premix Ex Taq II說明書：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，45個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s制作熔解曲線。每個樣本技術重復3次。

1.3.5 CD63的生物信息學分析 測序結果采用DNAMAN軟件進行序列比對及拼接；運用NCBI在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi)分析CD63基因的開放閱讀框并預測CD63蛋白保守結構域；應用PortScale(https://web.expasy.org/protscale/)和ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)軟件對豬CD63的理化性質(zhì)進行預測；采用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線預測磷酸化位點；應用NetNGlyc 1.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/和http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc)分別預測其N-糖基化位點和O-糖基化位點；運用德泰生物在線軟件(http://www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html和http://www.detaibio. com/tools/transmembrane.html)對CD63的信號肽和跨膜結構域進行預測；同時應用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)對豬CD63蛋白質(zhì)的二級結構進行預測；應用Phyre 2.0軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對豬CD63蛋白的三級結構進行預測；用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE _TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)軟件比較豬、人、牛、摩弗倫羊、羊駝、野駱駝、家貓、抹香鯨、北大西洋小須鯨、長江江豚等12個物種CD63蛋白氨基酸序列的相似性；采用MEGA X軟件構建上述物種基于CD63氨基酸序列的進化樹。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應用2-△△CT法分析qRT-PCR檢測結果，結果以平均值±標準誤表示。采用SPSS version 22.0軟件的單因素方差分析方法比較CD63基因在不同組織間的表達差異，用Duncan's法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 豬CD63基因CDS區(qū)的克隆及序列分析

NCBI數(shù)據(jù)庫中豬CD63基因序列為預測序列，本試驗中未能一次性成功擴增出該基因的完整CDS區(qū)序列，所以采用分段擴增，再進行拼接并結合與預測序列比對的方法，共獲得長度為838 bp的片段，該序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號為MN082631。圖1中各片段產(chǎn)物的大小與預期結果一致。運用NCBI上的開放閱讀框查找器分析本研究獲得的豬CD63基因序列，發(fā)現(xiàn)其含有一個長714 bp的ORF，共編碼237個氨基酸(圖2B)。

圖1 引物P1(A)及P2(B)的擴增結果 1，2. PCR產(chǎn)物；M. DL1 000 DNA MarkerFig. 1 Amplification results of primer P1 (A) and P2 (B) 1,2. PCR products;M. DL 1 000 DNA Marker

圖2 序列拼接結果(A)及預測的蛋白質(zhì)序列(B)Fig. 2 Sequence assembly result (A) and the predicted protein sequence (B)

2.2 豬CD63基因在不同組織中的表達譜

由圖3可以看出，CD63在各組織中均有表達，且在不同組織間表達量具有差異，在脂肪組織中表達量最高，其次是肝臟、肌肉、脾臟和心臟等組織，在腎臟中表達量最低。

圖3 馬身豬不同組織CD63基因的表達量 不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Fig. 3 Expression patterns of CD63 in different tissues of Mashen pig Different uppercase letters indicate highly significant difference(P<0.01)

2.3 豬CD63的生物信息學分析

2.3.1 CD63理化性質(zhì)分析 用ProtParam軟件對CD63的理化性質(zhì)進行了預測，結果表明CD63由237個氨基酸組成，其分子式為C1171H1855N297O315S22，相對分子質(zhì)量為25 839.73，理論等電點(PI)為7.40，說明豬CD63由中性氨基酸組成；其中Val(12.7%)、Ala(10.5%)、Leu(10.5%)、Gly(7.2%)、Cys(6.3%)和Phe(5.9%)為主要氨基酸；CD63蛋白帶負電荷的殘基數(shù)(Asp+Glu)為17，帶正電荷的殘基數(shù)(Arg+Lys)為18；其消光系數(shù)(mol·L-1·cm-1·γ=280 nm)為26 315，不穩(wěn)定系數(shù)為24.07，并預測其在哺乳動物紅細胞中的半衰期為30 h，說明CD63蛋白較穩(wěn)定；脂肪族氨基酸指數(shù)為113.08，平均親水性為0.716。疏水性分析結果顯示，CD63蛋白的最小疏水性指數(shù)為-2.744(Position:128)，最大疏水性指數(shù)為3.267(Position:56)，為疏水性蛋白(圖4)。

圖4 豬CD63蛋白疏水性分析Fig. 4 Hydrophobicity analysis of pig CD63 protein

信號肽和跨膜區(qū)域(圖5)及保守結構域(圖6)預測結果表明，CD63氨基酸序列不含信號肽，但是含有4次跨膜結構(13～35，50～72，85～107，205～227)，N-和C-末端都位于膜的細胞內(nèi)側，其功能域預測與結構域預測相一致。CD63糖基化位點預測結果顯示(圖7)，CD63有3個可能的N-糖基化位點，發(fā)生在“Asn-X-Ser/Thr”(X是除脯氨酸外的任一氨基酸，Asn為天冬酰胺，Ser為絲氨酸，Thr為蘇氨酸)的Asn殘基上，其中2個位點位于第3個與第4個跨膜結構域之間的胞外區(qū)內(nèi)，另一個在第1個與第2個跨膜結構域之間的胞外區(qū)內(nèi)，但沒有發(fā)現(xiàn)O-連糖基化位點。磷酸化預測結果顯示(圖8)，Ser磷酸化位點有6個，分別位于第51、91、160、167、196和232位；Thr磷酸化位點有4個，分別位于第44、48、75和152位；Tyr磷酸化位點有1個，位于第80位。

圖5 豬CD63蛋白的信號肽(A)和跨膜結構域(B)預測Fig. 5 Prediction of signal peptide (A) and transmembrane domain (B) of pig CD63 protein

圖6 豬CD63蛋白保守結構域分析Fig. 6 Conservative domain analysis of pig CD63 protein

圖7 豬CD63蛋白N-連糖基化位點和O-連糖基化位點預測Fig. 7 Prediction of N-linked glycosylation site and O-linked glycosylation site of pig CD63 protein

2.3.2 豬CD63蛋白高級結構預測 同時應用PredictProtein和SOPMA軟件對豬CD63蛋白質(zhì)的二級結構進行預測，結果如圖9所示。CD63的二級結構主要由α-螺旋(h)、延伸(e)、β-折疊(t)和無規(guī)則卷曲(c)組成，分別占58.23%、11.39%、5.49%和24.89%；采用Phyre2.0軟件預測CD63蛋白三級結構(圖10)，發(fā)現(xiàn)豬CD63均存在α-螺旋、β-折疊和disordred區(qū)域。

圖9 豬CD63蛋白二級結構預測Fig. 9 Prediction of secondary structure of porcine CD63 protein sequences

圖10 豬CD63蛋白三級結構預測Fig. 10 Prediction of tertiary structure of porcine CD63 protein

2.3.3 不同物種CD63氨基酸序列進化樹的構建 本研究獲得的馬身豬CD63氨基酸與野豬序列一致，用NCBI BLAST比較包括野豬、人、牛、長江江豚、摩弗倫羊等在內(nèi)的12個物種CD63氨基酸序列的相似性，結果表明豬的CD63與野駱駝的相似性最高，達90.72%；其次是羊駝、長江江豚、抹香鯨，相似性均達到90.30%。采用MAGE X軟件的鄰接法構建這12個物種的進化樹，如圖11所示，豬CD63與駱駝科的野駱駝和羊駝聚為一個分支，與鯨類和長江江豚較近，與其他5個物種的親緣關系比較遠，說明豬CD63可能與駱駝科間具有相似的功能。

圖11 12個物種CD63蛋白系統(tǒng)進化樹Fig. 11 CD63 protein system phylogenetic tree of 12 species

3 討 論

CD63作為四跨膜蛋白家族的表面膜蛋白之一，可通過4個跨膜結構域穿過質(zhì)膜，表明這些結構域可能參與某些細胞類型的信號轉導[20]。CD63已被定性為多種細胞類型的激活或分化標記，并且已知在細胞膜中與β1整合素、主要組織相容性復合抗原和其他四跨膜蛋白緊密結合[21-23]。本研究中對豬CD63理化性質(zhì)和結構預測，與前人結果一致[16]。馬身豬的CD63是一種比較穩(wěn)定的典型的4次跨膜蛋白，兩個胞外域分別與對應的配體結合，其N末端和C末端均位于細胞內(nèi)，與骨架蛋白及胞內(nèi)信號分子結合參與信號轉導。本研究中CD63蛋白消光系數(shù)為26 315，理論等電點(PI)為7.40，不穩(wěn)定系數(shù)為24.07，最小疏水性指數(shù)為-2.744(Position:128)，最大疏水性指數(shù)為3.267(Position:56)，屬于中性穩(wěn)定疏水蛋白，與在七鰓鰻中的研究結果相同[24]。通過相似性比對發(fā)現(xiàn)，豬CD63與野駱駝的相似性最高，達90.72%，其次是羊駝、長江江豚、抹香鯨等，相似性均達到90.30%。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，相較于哺乳動物來說，豬的CD63與駱駝科的羊駝和野駱駝親緣關系最近，其次是與鯨類和長江江豚的遺傳距離較近，符合物種進化規(guī)律。

CD63在免疫應答中發(fā)揮重要作用，除了CD63-MHC-II類復合物，在白細胞募集、吞噬及過敏等免疫反應中均具有重要地位。內(nèi)皮細胞表面的CD63能與P型選擇素相互作用調(diào)控白細胞的募集過程[25]。作為攻擊入侵病原體的主要細胞介導的防御機制，吞噬作用在哺乳動物的先天免疫反應中起重要作用。CD63在細胞內(nèi)吞和吞噬作用中起關鍵作用，有報道稱在人類樹突狀細胞中，CD63內(nèi)化的同時伴隨著釀酒酵母的吞噬[26]；Yu等[27]揭示了CD63在促進血細胞介導的吞噬作用中的確切作用。在過敏反應中，CD63可在特異性免疫球蛋白IgE介導的肥大細胞脫粒中起重要作用。Kraft等[28]研究表明，可將CD63作為過敏反應的重要組分，發(fā)現(xiàn)敲除CD63基因可顯著降低肥大細胞脫粒，從而減少體內(nèi)的急性過敏反應。本研究中，CD63基因在馬身豬的脂肪、肝臟、肌肉和脾臟的表達量較高，在心臟和腎臟中表達量較低，該結果與鱸魚和斑點叉尾鮰的表達結果類似[16，29]，均在肝臟和肌肉中表達較高。脂肪組織除了可以儲存脂肪外，還具有免疫調(diào)節(jié)功能。作為免疫器官[30]，脂肪組織中的T細胞是免疫代謝的關鍵因素[31]，CD63基因在脂肪組織中高表達，是因為脂肪組織中已鑒定出多種免疫細胞，包括B細胞，T細胞，巨噬細胞和嗜中性粒細胞，而CD63在這些細胞表面均表達。馬身豬的肌內(nèi)脂肪含量較高[32]，導致CD63在肌肉中的表達量也較高。此外肝臟可以選擇性富集自然殺傷細胞和殺傷性T細胞[33]，因此推測CD63基因在免疫器官脂肪組織、脾臟和肝臟中高表達，可能參與相關免疫調(diào)控，其作用機制有待進一步研究。

4 結 論

本研究成功獲得了馬身豬CD63基因的CDS區(qū)序列(MN082631)，全長714 bp，編碼237個氨基酸。生物信息學分析表明，CD63與駱駝科的羊駝和野駱駝同源性較高，為中性、親水、穩(wěn)定型四跨膜蛋白，二、三級結構預測顯示，該蛋白主要以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主。該基因在所有組織中均有表達，在脂肪組織中的表達量最高，其次是肝臟、肌肉和脾臟。本研究結果為深入探討CD63基因的結構和功能提供了參考。