葉酸代謝通路基因在肝癌中的表達及意義

孫文文 張凌云

原發性肝癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一，其中最主要的組織學類型的是肝細胞癌。肝臟是人體最重要的消化器官之一，是包括糖類、蛋白質、維生素等物質的代謝場所。葉酸是一種人體必需的B族維生素，它在人體中經過轉化變成四氫葉酸，而四氫葉酸能夠攜帶一碳單位參與核苷酸和脫氧核苷核酸的合成，可見葉酸在保持基因組穩定方面具有重要作用。分析葉酸代謝通路發現，甲硫氨酸合成酶(MTR)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、亞甲基四氫葉酸脫氫酶1(MTHFD1)、MTHFD2、線粒體系氨酸羥基甲基轉移酶1(SHMT1)和SHMT2在葉酸代謝中起著重要的作用。本研究主要通過生物信息學分析的方法，分析上述6種葉酸代謝通路的關鍵基因在肝癌組織中的表達數據，研究其與臨床預后、免疫調控之間的關系，為進一步研究葉酸代謝在肝癌的發生發展及預后中的意義提供理論依據。

資料與方法

一、在線數據庫基因表達水平分析

Oncomine數據庫(www.oncomine.org)和基因表達譜分析(GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)對葉酸代謝通路的關鍵基因在人肝癌組織及正常肝組織中的mRNA表達水平進行分析比較。以P<0.05、差異倍數>1.5倍為差異有統計學意義。

二、GEPIA預后分析

采用在線工具Kaplan-Meier生存曲線(www.kmplot.com)和GEPIA評估葉酸代謝通路關鍵基因mRNA表達的預后價值。

二、基因改變頻率分析

采用cBioPortal數據庫(http://www.cbioportal.org)分析肝癌患者中葉酸代謝通路關鍵基因改變的情況。

三、生物信息學分析

STRING(https://string-db.org/)和GeneMANIA(http://www.genemania.org)中分析葉酸代謝通路關鍵基因與其他基因或蛋白間的互作關系。

四、免疫浸潤細胞的相關性分析

TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數據庫中分析葉酸代謝通路關鍵基因在肝癌中與免疫細胞的相關性。

結 果

一、葉酸代謝通路相關基因在肝癌組織中的表達

采用Oncomine數據庫分析葉酸代謝通路關鍵基因(MTR、MTHFR、MTHFD1、MTHFD2、SHMT1和SHMT2)在人肝癌組織與正常肝組織中的表達。在肝癌組織中MTR的mRNA表達水平是肝臟正常組織的2倍，肝癌組織中MTHFD2的mRNA表達水平是肝臟正常組織的1.6倍，差異均有統計學意義(圖1A)。通過GEPIA數據庫對這些基因進行分析，其表達趨勢與Oncomine數據庫中的數據基本一致，但差異無統計學意義(圖1B)。

圖1 葉酸代謝關鍵基因在Oncomines和GEPIA數據庫中的表達

二、葉酸代謝通路關鍵基因的改變

cBioPortal數據庫中分析肝癌中葉酸代謝關鍵基因的改變，結果顯示基因改變主要包括基因擴增、缺失突變和錯義突變。MTR、MTHFR、MTHFD1、SHMT1和SHMT2均存在基因擴增改變，基因缺失突變也是MTHFR和SHMT1常出現的基因變異，其中MTR中存在8%的基因突變。除SHMT1外，這些葉酸代謝基因均存在不同程度的錯義突變(圖2)

三、葉酸代謝通路關鍵基因在肝癌預后中的價值

Kaplan-Meier生存分析顯示，MTHFR的高表達與肝癌預后不良相關(HR=1.49，P=0.04)；而MTHFD1和SHMT1的高表達則表示肝癌患者的預后良好(HR=0.63，P=0.008 9和HR=0.52，P=0.000 31；圖3A)。MTHFD2和SHMT1的高表達均與肝癌患者的無病進展期呈正相關(HR=0.72，P=0.028和HR=0.53，P=1.9e-05；圖3B)。在進一步對葉酸代謝基因與肝癌患者不同病理分期相關性分析中，發現SHMT1與肝癌患者臨床分期相關，其表達水平在不同的肝癌分期中差異有統計學意義(P=0.000 415；圖3C)，而其他基因差異無統計學意義。

四、葉酸代謝通路關鍵基因的互作圖

在STRING(圖4A)和GeneMANIA(圖4B)數據庫中分析葉酸代謝通路基因之間的相互作用關聯圖，可見除了各基因之間相互作用外，還與其他很多基因存在關聯。在兩個數據庫的分析結果中均發現葉酸代謝通路關鍵基因與ATIC基因存在相互作用。

圖2 葉酸代謝關鍵基因在肝癌中的基因改變

A：總生存期；B：無疾病進展期；C：臨床分期圖3 葉酸代謝關鍵基因表達與肝癌患者臨床資料的相關性分析

圖4 葉酸代謝通路關鍵基因的分子互作圖

五、葉酸代謝通路與機體免疫系統的關系

肝癌是一種與機體免疫系統息息相關的惡性腫瘤，通過TIMER數據庫分析了葉酸代謝通路與機體免疫的關系。MTHFR在肝癌中的表達與B細胞(Cor=0.1558,P=4.02e-03)、CD8+T淋巴細胞(Cor=0.121,P=2.58e-02)、CD4+T淋巴細胞(Cor=0.343,P=6.44e-11)、巨噬細胞(Cor=0.302,P=1.32e-08)、中性粒細胞(Cor=0.371,P=1.04e-12)和樹突狀細胞(Cor=0.317,P=2.25e-09)的浸潤呈正相關；MTHFD2的表達與B細胞(Cor=0.466,P=6.06e-20)、CD8+T淋巴細胞(Cor=0.515,P=1.34e-24)、CD4+T淋巴細胞(Cor=0.501,P=2.66e-23)、巨噬細胞(Cor=0.608,P=7.33e-36)、中性粒細胞(Cor=0.513,P=1.41e-24)和樹突狀細胞(Cor=0.672,P=4.64e-46)的浸潤也呈正相關(P<0.05)但并未發現其他葉酸代謝通路基因與機體免疫浸潤細胞之間的相關性(圖5)。

討 論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥致死率中位于第五位[1]，在中國的癌癥致死率中位于第四位[2]。葉酸為DNA合成提供嘌呤和胸苷，有研究顯示葉酸缺乏或代謝障礙與肝癌發病風險增高相關[3]。肝臟本身是儲存葉酸的主要器官，所以葉酸代謝通路的異常更有可能與肝癌的發生發展密切相關。本文主要對葉酸代謝通路的關鍵基因(MTR、MTHFR、MTHFD1、MTHFD2、SHMT1和SHMT2)在肝癌中的表達、基因突變類型以及對肝癌患者預后、免疫相關性等方面進行研究。

MTR是體內唯一能轉化5-甲基四氫葉酸的酶，有研究顯示MTR基因的錯義突變可從翻譯水平抑制MTR的表達[4]，導致MTR表達量的降低，造成DNA的低甲基化，參與肝癌的發生發展。本研究發現，在肝癌中MTR基因的改變主要為基因擴增和錯義突變，而其表達量與肝癌患者的總生存期、無疾病進展期等并無顯著相關性。通過這些數據可以推斷出MTR在肝癌發生發展中的作用可能與該基因的功能缺失有關，其表達量的增加可能并不會對肝癌細胞生物學行為產生影響。

MTHFR基因突變是引起該酶活性缺乏和降低的主要機制[5,6]。本研究發現肝癌中MTHFR基因的改變主要為缺失突變，且肝癌組織中MTHFR的相對低表達與肝癌患者的生存期延長存在顯著相關性。另外，MTHFR與多種免疫細胞浸潤存在顯著相關性，如T細胞、B細胞、巨噬細胞等，說明MTHFR與肝癌患者的免疫微環境調控相關，也說明葉酸代謝通路在某種層面上參與機體免疫系統的調控。

有數據表明，MTHFD2蛋白在肝細胞癌組織中高表達[7]，這與本研究數據一致。但也有研究顯示癌組織中MTHFD1[8]和MTHFD2[7]的高表達與肝癌患者的預后呈負相關。本研究通過生物信息學分析的數據顯示MTHFD1的高表達與肝癌患者的總生存期存在正相關，MTHFD2與和肝癌患者的無疾病進展期呈正相關。這些數據之間的差異可能需要通過進一步擴大樣本量來校正。在MTHFD與免疫浸潤細胞的相關性分析中，發現MTHFD2與多種免疫細胞浸潤相關，同MTHFR影響免疫細胞浸潤一起，這些數據表明葉酸代謝通路與機體免疫相關，提示針對肝癌的免疫治療如若聯合靶向葉酸代謝通路的藥物，可能會起到更優的治療效果。

圖5 葉酸代謝通路關鍵基因與免疫細胞浸潤的相關性分析

SHMT包括SHMT1和SHMT2，SHMT2在多種腫瘤中高表達，抑制SHMT2的表達可以抑制腫瘤細胞的生長和侵襲[9,10]。本研究發現SHMT1在肝癌中多為基因擴增和缺失突變，SHMT2多表現為基因擴增及錯義突變，提示肝癌中SHMT除了表達量的改變會影響肝癌的惡性生物學行為外，其基因功能的缺失也可能參與肝癌的發生發展過程。

通過在線數據庫對這些基因進行基因或蛋白質互作分析，在兩個數據庫的分析結果中均發現與異硫氰酸烯丙酯(AITC)基因存在相互關聯。研究顯示AITC參與腫瘤細胞的有絲分裂，與腫瘤細胞的凋亡相關[11]。AITC有抗細胞增殖、抗血管新生的作用，能通過影響巨噬細胞發揮免疫調節效應[12-14]?？梢酝茢啵~酸代謝通路基因可與AITC相互作用，影響肝癌的發生發展。

綜上，葉酸代謝通路的關鍵基因在肝癌的發生發展過程中起著重要的作用，肝癌患者中這些基因的改變除了影響葉酸代謝通路的調控以外，還能夠通過影響人體的免疫微環境，以及與其他基因及代謝通路一起參與肝癌的發生發展過程。