超高效液相色譜－串聯質譜法檢測中藥飲片中8種黃色素類染色劑*

劉延忠，劉東升，朱旭江，姚世霞

（1.甘肅省醫療器械檢驗檢測所，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州730070）

中藥飲片作為中藥提取物和中成藥的基本原料，市場需求量大，染色劑染色偽制的常用中藥飲片的外觀性狀接近正品，不易辨別，導致不法分子將假、劣藥材染色后冒充正品[1－2]。據報道，大部分黃色類染色劑不利于人體健康，如金胺O、金橙Ⅱ等黃色素類染色劑對人體可造成不同程度危害，故禁止用于中藥飲片的染色。近年來，雖然藥監部門加大了中藥非法染色的打擊力度，金胺O等染色劑的染色現象有所減少，但仍有不法商販使用其他黃色素類染色劑進行非法染色。目前，國家藥品監督管理局已頒布的中藥飲片染色摻假物質補充檢驗多采用薄層色譜（TLC）法、高效液相色譜（HPLC）法對單個藥材及飲片中的一種或幾種色素進行檢測[3－4]，品種覆蓋面窄，檢測方法靈敏度低，準確性差，易出現假陽性，不能有效控制中藥飲片的質量。超高效液相色譜－串聯質譜聯用法（UPLC－MS／MS）廣泛用于中藥非法染色劑的檢測[5－14]。本研究中建立了同時測定蒲黃、黃芪、黃連、黃柏和延胡索等多種中藥飲片中8種黃色素類染色劑含量的UPLC－MS／MS法，為中藥飲片中黃色素類染色劑的檢測提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LCMS－8045型超高效液相色譜－三重四極桿液質聯用儀（日本島津公司）；ME204型和MS205DU型分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度均為0.01 mg）；KQ－500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；XK80－A型快速混勻器（江蘇新康醫療器械有限公司）；SHY－2A型多功能水浴恒溫振蕩器（金壇市大地自動化儀器廠）；5430R型離心機（德國艾本德公司）；HGC－24A型氮氣吹干儀（天津市高科技發展有限公司）；Research plus加樣槍（德國艾本德公司，規格為10，100 μL）；Xiboshi一次性針式過濾器（美國戴安公司，規格為0.22，0.45 μm）。

1.2 試藥

檸檬黃對照品（批號為30117，純度為90.0%）；日落黃對照品（批號為91001，純度為87.0%），金胺O對照品（批號為00701，純度為79.0%），金橙Ⅱ對照品（批號為21116，純度為96.3%），堿性橙22對照品(批號為6A16a050，純 度 為91.5%)，均 購 于Dr.Ehrenstorfer GmbH；金橙Ⅰ對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號為S11N8D48136，純度≥98%)；燦爛黃對照品(批號為A2689A，純度為95%)，皂黃對照品（批號為D1714050，純度為98%），均購于上海Aladdin公司；乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸銨均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。藥材樣品信息見表1。

表1 藥材樣品信息Tab.1 Information of Chinese herbal pieces

2 方法與結果

2.1 UPLC－MS／MS條件

色譜條件：色譜柱為Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）；流動相為乙腈（A）－0.02 mol／L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫(0～12 min時90%B→55%B，12～20 min時55%B→30%B，20～40 min,時30%B→15%B)；流速為0.2 mL／min；柱溫為30℃；進樣量為5 μL。

質譜條件：電離方式為正離子電噴霧離子源（ESI＋），反應監測模式（MRM）；DL管溫度為350℃；干燥氣流速為10 L／min；霧化氣流速為3.0 L／min；接口電壓為4.0 kV。總離子流圖見圖1，各成分質譜信息見表2。

表2 8種黃色表類染色劑質譜信息Tab.2 Mass spectrum information of eigh yellow pigments

圖1 8種黃色素類染色劑混合對照（中等線性濃度）的總離子流圖1.Lemon yellow 2.Sunset yellow 3.Brilliant yellow 4.OrangeⅠ5.Golden orangeⅡ6.Auramine O 7.Soap yellow 8.Alkaline orange 22Fig.1 Total ion flow diagram of mixed reference（medium linear concentration）of eight yellow pigments agents

2.2 溶液制備

分別取檸檬黃、日落黃、金橙Ⅰ、燦爛黃、金胺O、金橙Ⅱ、皂黃和堿性橙22對照品各10 mg，精密稱定，加70%乙醇分別制成質量濃度為100 μg／mL的單標混合貯備液，于4℃條件下保存。取上述單標混合貯備液各1～3 mL，置50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。取樣品適量，粉碎，取2.0 g，精密稱定，加70%乙醇20 mL，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，冷卻至室溫，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察和檢測限確定：分別精密吸取2.2項下稀釋1倍后的單標混合貯備液，加70%乙醇，分別制成系列混合對照品溶液。注入超高效液相色譜－三重四極桿液質聯用儀，按2.1項下色譜條件測定染色劑的峰面積積分值。以混合對照品溶液質量濃度為橫坐標（X，μg／mL）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到近原點的一條直線，計算回歸方程和相關系數。結果見表3。可見，8種黃色類染色劑質量濃度在0.2～30.0 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。方法的檢測限為0.05～0.10 μg／g。詳見表3。

表3 8種黃色素類染色劑回歸方程、線性范圍和檢測限Tab.3 Regression equation，linear range and LOD of eight yellow pigments

精密度和準確度試驗：采用標準添加法，稱取完全不含染色劑的空白樣品6份，每份1.0 g，精密稱定，分別精密加入混合對照品溶液各2 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果平均回收率為89.83%～99.52%，RSD為2.14%～3.67%（n＝6）。詳見表4。

表4 精密度和準確度試驗結果（n＝6）Tab.4 Results of precision and accuracy tests（n＝6）

2.4 樣品中非法添加黃色素類染色劑檢測

采用UPLC－MS／MS法，按2.1項下色譜條件對26批蒲黃（2批）、黃芪、黃連、黃柏和延胡索（各6批）樣品中非法添加黃色素類染色劑進行檢測，結果樣品均未檢出黃色素類染色劑。

3 討論

3.1 提取條件優化

曾考察不同提取溶液(甲醇、乙醇、70%甲醇溶液、70%乙醇溶液)對測定結果的影響，結果經70%乙醇溶液提取，供試品溶液進樣后色譜峰峰形良好，且雜峰較少。綜合考慮，以70%乙醇溶液為提取溶劑。考察不同提取方法(浸泡、超聲、回流提取法)對測定結果的影響，結果超聲提取法簡便、快捷，且提取效率較高，故采用超聲提取法。考察不同體積(10，20，30，50 mL)的70%乙醇溶液和不同超聲時間(15，30，45，60 min)對測定結果的影響，最終選用20 mL 70%乙醇溶液超聲處理30 min。

3.2 質譜條件優化

根據8種染色劑分子的結構特征，分別在正離子和負離子模式下進行全掃描，結果在正離子模式下各染色劑的響應值均高于負離子模式下的響應值，故選用正離子模式；通過UPLC的自動進樣器直接進樣（不連接色譜柱），對毛細管電壓、錐孔電壓及質譜分辨率等條件進行優化，確定接口電壓為4.0 kV。在擬訂質譜條件下，分別以分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描，選取響應最高且干擾較小的子離子作為定量離子（MRM模式），以響應值次之的作為定性離子，并對目標化合物二級質譜的碰撞能量等質譜分析參數進行優化。最終確定了質譜條件。

3.3 流動相優化

在質譜分析過程中，由于待測樣品（陽性含染色劑）中含有偶氮鍵和季銨鹽，故流動相中常加入一定濃度的甲酸和銨鹽（甲酸銨或乙酸銨），有助于正離子的響應和峰形的改善。選擇乙腈－0.02 mol／L乙酸銨溶液、甲醇－0.02 mol／L乙酸銨溶液、乙腈－0.02 mol／L甲酸銨溶液和甲醇－0.02 mol／L甲酸銨溶液4種流動相體系進行分析。結果顯示，采用乙腈－乙酸銨體系進行梯度洗脫時，樣品分離度和峰形均較好，且能進一步提高分析樣品的信噪比和靈敏度。

3.4 方法評價

本研究中建立了同時測定中藥飲片中可能添加的8種黃色素類染色劑的UPLC－MS／MS法，該方法穩定性好，可操作性強，準確度高，提高了工作效率，降低了檢測成本。與HPLC法相比，進一步提高了方法的準確度和靈敏度，檢測的色素種類較全面，有效地提高了檢測速度，可為監測中藥飲片中非法染色提供參考。