氣相色譜－質(zhì)譜法測定葛根和丹參提取回收乙醇中5種揮發(fā)性雜質(zhì)含量

辜俊鑫，史謝飛，李 斌，張學(xué)霞

（1.北京同仁堂科技發(fā)展成都有限公司，四川 成都610100；2.中國測試技術(shù)研究院，四川 成都610021）

藥品和藥用溶劑中有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)的潛在危害已逐漸被重視，控制其含量是目前國內(nèi)新藥研發(fā)的關(guān)鍵制約因素[1]。藥用乙醇為常見溶劑，常用于藥品有效成分的提取。使用新乙醇提取時，用量大，藥材提取成本高；連續(xù)使用回收乙醇又可能致殘留的揮發(fā)性雜質(zhì)對提取產(chǎn)品造成污染風(fēng)險。藥品及藥用輔料中揮發(fā)性雜質(zhì)多采用溶解后直接進(jìn)樣分析[2－5]或頂空進(jìn)樣分析[6－10]。回收乙醇中揮發(fā)性雜質(zhì)的種類及含量受影響因素較多，存在較多不確定性，氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)[11－12]法更有利于成分定性和定量分析。本研究中建立了測定葛根和丹參提取回收乙醇中揮發(fā)性雜質(zhì)甲醇、苯、乙醛、乙縮醛、4－甲基－2－戊醇含量的方法，以期為確定回收乙醇的使用周期或循環(huán)使用次數(shù)提供客觀依據(jù)，達(dá)到既降低成本又能確保藥品質(zhì)量的目的。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

R501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市英峪儀器廠）；6890N－5973inert型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；XW－80A型渦旋混合儀（上海馳唐電子公司）。

1.2 試藥

乙醇（藥用級，新鄉(xiāng)市先豐醫(yī)藥新材料有限公司，批號為F－01－190301）；乙醛對照品（美國Fluka公司，純度為99.5%）；苯對照品（天津市化學(xué)試劑研究廠，純度為99.9%）；乙縮醛對照品（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，純 度 為98.0%）；乙 腈、甲 醇 對 照 品（Sigma－ALDRICH，純度為99.9%）；4－甲基－2－戊醇對照品（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，純度為99.5%）；丹參（批 號 為Z－24－190201），葛 根（批 號 為Y－01－190301），均購于北京同仁堂科技發(fā)展成都有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentDB－624UI柱（60m×250μm，1.4μm）；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；流速：1.0 mL／min；分流比：10∶1；進(jìn)樣口溫度：230℃；檢測器：質(zhì)譜儀；離子化能量：70 eV；溶劑延遲時間：4.4 min；柱溫：程序升溫，40℃保持10 min，以5℃／min的速率升至120℃，再以40℃／min的速率升至220℃并保持3 min；掃描方式：離子監(jiān)測，乙醛選擇離子比（豐度比）為44∶42∶43（100∶20∶52），苯選擇離子比（豐度比）為78∶51∶77（100∶14∶22），乙縮醛選擇離子比（豐度比）為45∶73∶103（100∶79∶28），甲醇選擇離子比（豐度比）為31∶30∶32（100∶20∶52），4－甲基－2－戊醇選擇離子比（豐度比）為45∶69∶87（100∶33∶10）。

2.2 樣品及溶液制備

樣品制備：實(shí)驗(yàn)室分別用藥用乙醇模擬提取葛根和丹參藥材，提取溶劑倍數(shù)、提取時間、提取溫度、提取乙醇濃度均與生產(chǎn)工藝一致，只是同比例縮小提取量。提取完全后過濾、減壓濃縮得回收乙醇，再使用回收乙醇作為下次藥材的提取溶劑，回收乙醇在回收過程會有損失，在提取下次的藥材時按回收乙醇的體積同比例縮小，如此反復(fù)操作至回收乙醇體積過少無法進(jìn)行提取為止。

對照品單標(biāo)貯備液：取乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇對照品各適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，保存于－4℃冰箱中備用。

對照品混標(biāo)貯備液：分別移取適量乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇單標(biāo)貯備液，置10 mL容量瓶中，制成乙醛質(zhì)量濃度為200 mg／L，苯質(zhì)量濃度為40 mg／L，乙縮醛質(zhì)量濃度為200 mg／L，甲醇質(zhì)量濃度為4 000 mg／L，4－甲基－2－戊醇對照品質(zhì)量濃度為6 000 mg／L的對照品混標(biāo)貯備液，保存于－4℃冰箱中備用。

供試品溶液：取5 mL回收乙醇樣品，置10 mL容量瓶中，加乙腈定容，混勻，即得。

混合對照品溶液：取對照品混標(biāo)貯備液250 μL，加乙腈定容，混勻，作為對照品溶液，即乙醛質(zhì)量濃度為5 mg／L，苯質(zhì)量濃度為1 mg／L，乙縮醛質(zhì)量濃度為5 mg／L，甲醇質(zhì)量濃度為100 mg／L，4－甲基－2－戊醇質(zhì)量濃度為150 mg／L。

對照品加供試品溶液：準(zhǔn)確移取5 mL回收乙醇樣品，置10 mL容量瓶中，加上述對照品混標(biāo)貯備液250 μL，再加乙腈定容，混勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別取乙腈（作為空白溶劑），2.2項(xiàng)下供試品溶液、混合對照品溶液、對照品加供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果空白溶劑和供試品溶液中其他化合物均不干擾待測物的測定，且混合對照品溶液和對照品加供試品溶液中待測物的保留時間一致，定量離子對比例和定性離子對的豐度比例一致，表明方法專屬性符合要求。詳見圖1。

圖1 氣相色譜－質(zhì)譜圖1.acetaldehyde 2.methanol 3.benzene 4.acetal 5.4－methyl－2－pentanolA.Blank solvent B.Test solution C.Mixed reference solution D.Reference and test solutionFig.1 GC－MS spectrum

線性關(guān)系考察：分別移取乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇單標(biāo)貯備液適量，用乙腈配制成乙醛質(zhì)量濃度分別為10.0，7.5，6.0，5.0，4.0，2.5，1.0 mg／L，苯 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為2.0，1.5，1.2，1.0，0.8，0.5，0.2 mg／L，乙縮醛質(zhì)量濃度分別為10.0，7.5，6.0，5.0，4.0，2.5，1.0 mg／L，甲醇質(zhì)量濃度分別為40，30，24，20，16，10，4 mg／L，4－甲基－2－戊醇質(zhì)量濃度分別為60，45，36，30，24，15，6 mg／L的系列對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。取溶液適量，注入GC－MS分析儀，每個質(zhì)量濃度進(jìn)樣1次，共進(jìn)7個點(diǎn)。以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度（X，mg／L）為橫坐標(biāo)、定量離子峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行性回歸，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r）。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察、檢測限、定量限試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of linear relation test，LOD and LOQ

檢測限和定量限確定：將不同質(zhì)量濃度的對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液注入GC－MS儀分析，以信噪比（S／N）為3時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測限，S／N為10時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇的RSD分別為3.35%，3.43%，4.02%，2.85%，2.19%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對照品加供試品溶液6份，分別注入GC－MS儀測定。結(jié)果乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇的RSD分別為3.46%，4.97%，4.66%，2.17%，0.55%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對照品加供試品溶液，分別于0，2，5，8，16，24 h時注入GC－MS儀測定。結(jié)果對照品加供試品溶液冷藏放置24 h內(nèi)無其他雜質(zhì)峰生成，乙醛、苯、乙縮醛的RSD均小于6%（n＝6），甲醇、4－甲基－2－戊醇的RSD均小于3%（n＝6），表明對照品加供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知各化合物含量的回收乙醇，加入2.2項(xiàng)下混合對照品溶液，各化合物均平行6份，分別注入GC－MS儀測定，計(jì)算回收率。結(jié)果乙醛、苯、乙縮醛、甲醇、4－甲基－2－戊醇的平均回收率分別為89.56%，94.71%，94.85%，95.20%，91.41%，RSD分別為4.25%，5.08%，4.45%，2.18%，0.76%（n＝6）。

2.4 樣品含量測定

取樣品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定各雜質(zhì)的含量。結(jié)果見表2。

表2 回收乙醇樣品中各揮發(fā)性雜質(zhì)含量測定結(jié)果（%）Tab.2 Determination of volatile impurities in recyeled ethanol samples（%）

3 討論

由表2可知，回收乙醇中未檢出苯和4－甲基－2－戊醇；檢出乙醛、乙縮醛和甲醇，且隨回收乙醇使用次數(shù)的增加而增加，呈富集趨勢。循環(huán)使用超過200次的回收乙醇中乙醛、乙縮醛、甲醇均已超過藥典對藥品溶劑殘留限度的規(guī)定，不符合藥品質(zhì)量要求，可能會給藥品質(zhì)量造成風(fēng)險。

本研究采用GC－MS法分析，發(fā)現(xiàn)除甲醇、乙醛、乙縮醛、苯、4－甲基－2－戊醇5種揮發(fā)性雜質(zhì)外，還有其他多種揮發(fā)性雜質(zhì)。揮發(fā)性雜質(zhì)種類多少和含量高低除與藥材直接相關(guān)外，也受生產(chǎn)過程中提取時間、提取溫度、回收溫度等環(huán)節(jié)影響。因此，回收乙醇中揮發(fā)性雜質(zhì)的種類及含量復(fù)雜多變，具有不確定性。為確保藥品質(zhì)量，應(yīng)制訂回收乙醇的使用周期或循環(huán)使用次數(shù)。可先暫定一個使用周期或循環(huán)使用次數(shù)，期間多次檢測揮發(fā)性雜質(zhì)，收集和積累數(shù)據(jù)，分析回收乙醇中揮發(fā)性雜質(zhì)的含量和變化趨勢，并結(jié)合揮發(fā)性雜質(zhì)在產(chǎn)品中的殘留情況，綜合考慮并最終確定該品種回收乙醇的使用周期或循環(huán)使用次數(shù)。

方法學(xué)考察結(jié)果表明，所建立方法的回收率、精密度、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果均符合2020年版《中國藥典(四部)》[13]分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中相關(guān)規(guī)定，能確保回收乙醇分析結(jié)果的準(zhǔn)確性與客觀性。因本次提供的樣本及測定雜質(zhì)種類有限，不能全面分析葛根和丹參提取回收乙醇中揮發(fā)性雜質(zhì)的含量和變化趨勢，但對藥品生產(chǎn)中類似回收乙醇的使用具有指導(dǎo)意義。