間充質干細胞來源的細胞外囊泡用于骨關節炎治療的研究進展

蔡龍云 林宗漢

【摘要】骨性關節炎是一種關節退行性疾病，隨著人口老齡化問題的加重，該疾病的發病率也呈現出逐漸上升的趨勢，成為全球醫學界普遍面臨的醫療難題。間充質干細胞的來源的細胞外囊泡是目前關于骨關節炎治療的一項新型研究。本文對細胞外囊泡的的生物學特點、作用機制、增強其作用效果的預處理策略及干細胞來源和特性等方面的研究進展作一總結，論述其未來運用的可能性。

【關鍵詞】骨關節炎;間充質干細胞;細胞外囊泡;綜述

【中圖分類號】R684.3 ?【文獻標識碼】A ? 【文章編號】2026-5328（2021）01-113-05

1.前言：

骨性關節炎（OA） 是一種涉及整個關節的慢性退行性疾病，其主要病理改變是關節滑膜炎癥，軟骨退化、缺損，軟骨下骨再生及骨贅形成。目前的觀點認為，骨關節炎的發病基于關節組織的損傷和修復之間復雜生理關系的失衡，而不是一種簡單的機械性改變。近些年來，間充質干細胞（MSC）被越來越多地運用到骨關節炎的治療研究中。而細胞外囊泡作為MSC旁分泌作用的重要載體包含親代細胞的關鍵表面標志物和信號分子并且具有類似的抗炎和營養特性，能起到和MSC同樣的治療作用，因此基于 MSC旁分泌作用的去細胞研究逐漸成為OA治療的新領域。

2.細胞外囊泡概述：

細胞外囊泡（EV）是指從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的具有雙層膜結構的囊泡小體，根據其大小和釋放方式可以大致分為3種類型：外泌體（直徑30～100nm）、微囊泡（直徑100～1000nm）和凋亡小體（直徑50～4000nm）。外泌體起源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到細胞外基質中;而微囊泡是由細胞膜的向外出芽產生。它們攜帶的多種蛋白質、脂類、DNA、mRNA、miRNA等反映了親代細胞的生物學狀態，通過受體-配體相互作用，直接膜融合和內吞作用等三種方式作為信號傳導復合物在細胞間發揮作用，介導靶細胞活化[1]。與MSC相比EV自身不具有增殖特性，同時易于生產、保存和轉移、靜脈注射更加安全、免疫原性更低，因此更適合作為疾病治療的工具。

3. EV在OA治療中的作用

3.1 EV減輕OA炎癥反應

炎癥是貫穿OA過程始終的最主要的病理變化，目前普遍認為IL-1β、TNF-α和IL-6在OA病理變化中起主要作用，而NF-κB信號通路作為細胞炎癥反應和免疫應答的關鍵通路，通過介導以上炎癥因子的產生也在OA進程中起關鍵作用。

已經觀察到MSC來源的EV可以下調TNF-α、IL-6、NF-κB和IFN-γ的mRNA表達[2]，這表明EV可以通過直接抑制炎癥因子的表達以及干預NF-κB信號通路來減輕炎癥。EV分泌的肝細胞生長因子（HGF）通過阻止激活的p65NF-κB與RANTES啟動子中的κB元素結合從而阻止trans激活其靶基因的轉錄，阻斷NF-κB信號傳導[3];TGFBI也可以通過穩定NF-κB抑制劑IκBα，負調控Toll樣受體等減少NF-κB信號傳導[4][5]。此外，NF-κB作為TLR信號通路下游的轉錄因子之一也受TLR信號的激活，目前已經發現多種miRNA（miR-146a、miR-146b、miR-497、miR-106a、miR-20b、miR-21等）通過作用于TLR-NF-κB途徑上的不同位點如MyD88、IRAK1、TRAF6、IRAK4等來負調控該信號的激活[6]。由此可知EV對OA炎癥的抑制可以通過其旁分泌作用中的多種細胞因子及miRNA對NF-κB信號通路的干預來實現。

3.2 EV對OA的免疫調節作用

目前研究認為軟骨組織的損傷或老化所形成的組織微碎片以及年齡、肥胖等因素均可能誘發關節內的自身免疫過程，這一過程主要由滑膜組織中多種免疫細胞、補體系統等介導，激活一系列炎癥信號通路，引起炎癥因子及組織蛋白酶的釋放，加重軟骨損傷[7]。其中巨噬細胞在該過程中起主要作用，尤其是經典型巨噬細胞（M1），通過產生各種促炎細胞因子加劇滑膜炎癥，同時可以激活滑膜成纖維細胞釋放MMPs。相反替代性活化巨噬細胞（M2）則被認為具有抗炎和組織修復特性。此外，樹突狀細胞（DC）、T細胞、B細胞及自然殺傷細胞（NK）等也不同程度參與關節內免疫反應，而現有的研究表明EV對上述免疫細胞均有不同程度的抑制作用[8]。

MSC衍生的EV內含有多種免疫調節因子，如TGF-β、HGF、IDO-1、IL-1O、IL-1RA等，這些因子抑制并減輕NK細胞的增殖和細胞毒性;減少輔助型T細胞Th1和Th17的產生并且抑制Th1和Th17細胞中免疫抑制Treg的轉化;抑制IL-1和IL-1R的結合;調節TNF-α的局部濃度，減少NFκB的激活[9]。尤其是對OA中巨噬細胞的作用調節已在大量的研究中證明，IL-10、PGE2和IDO等可溶性因子等通過不同的方式促進M1型巨噬細胞向M2型極化同時進一步影響其他免疫細胞的增殖、分化，抑制炎癥反應，促進組織修復[10];另外，EV中的多種miRNA也參與巨噬細胞極化的調節，如：miR-146、miR-216a-5p、miR-27a-3p、let-7b、miR-182等[11] ?？傊珽V通過上述免疫調節作用有利于減緩OA進程，促進組織修復;同時這種自身免疫調節一定程度上也解釋了其在進入人體后的相對安全性，因為到目前為止尚未有人體和動物試驗中EV植入后明顯免疫反應的報道。

3.3 EV對軟骨降解酶的抑制作用

我們已經發現人類關節透明軟骨由95%的細胞外基質（ECM）和僅5%的稀疏分布的軟骨細胞組成，而細胞外基質則主要由II型膠原蛋白和蛋白聚糖組成。從OA的長期病理進程來看，早期以膠原蛋白的降解為主，后期則是蛋白聚糖的降解。MMPs和ADMATs是兩類在OA軟骨退化中其主要作用的降解酶，分別負責上述II型膠原蛋白和蛋白聚糖的降解。

NF-κB可以直接或間接誘導基質降解酶和其他OA相關因子的表達，從而導致異常的軟骨分解代謝途徑。 NF-κB通過位于MMP1、MMP9和ADAMTS5基因啟動子中的NF-κB反應元件誘導分解代謝基因的表達，并促進OA主要促炎和破壞性介質的表達，包括COX2、PGE2和INOS。此外NF-κB信號的激活可以上調ELK1和ELF3、HIF-2α等轉錄因子而誘導上述降解酶類表達。如活化的HIF-2α通過與位于分解基因啟動子中的HIF-2α結合基序結合，促進基質降解酶的表達;此外，HIF2α的靶基因CCAAT/增強子結合蛋白β（C/EBPβ）也可通過直接誘導MMP13的表達而加重OA的進展[12]。通過對NF-κB信號通路與基質降解酶關系的發現，結合前面論述表明EV通過對多種炎癥因子及NF-κB信號通路的抑制而減少MMPs和ADAMTs的表達。此外，EV直接分泌的TIMP3可緊密結合與細胞外基質中，抑制多種MMPs對軟骨細胞外基質的降解[13];PAI-1作為兩種纖溶酶原激活物uPA和tPA的主要生理抑制劑，也能抑制纖溶酶依賴性MMPs的激活，因而一定程度上減少MMPs對ECM蛋白的降解[14]。

3.4 EV對軟骨組織的營養修復作用

除了以上敘述的抗炎和降解酶抑制作用外，EV也分泌多種營養因子促進細胞增殖并觸發內源性軟骨修復分子的形成。TGF-β、IGF-1等可以刺激蛋白聚糖、COL2A1、COMP、HA等軟骨細胞外基質主要成分的產生，同時減輕OA炎癥反應，調節軟骨細胞肥大，從而在軟骨細胞發育和細胞穩態調節中發揮重要作用[15][16]。bFGF本身則是軟骨細胞外基質中較為豐富的一種細胞因子，通過與細胞表面受體結合而激活合成代謝途徑，抑制聚集蛋白聚糖酶的活性[17]。骨形態生發蛋白（BMPs）作為TGF-β家族成員之一，同樣可以由EV分泌，其中BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP7、BMP9等均對軟骨的形成和修復具有促進作用[17]?？傊?，EV通過將多種蛋白因子傳遞到關節軟骨損傷部位，發揮其抗炎及營養作用促進軟骨組織的修復。

4.EV治療作用改善的策略

一些針對ASC的研究發現，經炎性條件下的預處理能夠在一定程度上增強EV的免疫調節作用，并且目前認為該作用機制至少部分歸因于EV中部分miRNA（miR-34a-5p、miR-146a-5p、miR-21-5p）表達的上調以及這些miRNA介導的M1型巨噬細胞向M2型的極化[18]。缺氧預處理也是目前運用較多的方式，劉宏斌等的一項研究表明低氧條件下培養的ASC分泌更多的EV，并且引起一系列特殊的miRNAs的表達改變，尤其是和親代MSC相比差異化表達的miRNAs優先調控機體細胞的黏附、細胞分化、細胞增殖、轉運和凋亡等生物學功能，提示其在組織損傷和修復中的重要作用[19]。

通過使EV中某些作用機制明確的miRNA的過表達來增強治療作用的嘗試也在不同類型的MSC中開展。如彭凱等采用慢病毒轉染法將用miR-140-5p轉染人臍帶間充質干細胞（huc-MSC），結果表明過表達miR-140-5p的huc-MSC通過抑制NLRP3、caspase-1、MMP-13和ADAMTs-5的表達從而顯著抑制骨關節炎大鼠的軟骨退變并顯著提高軟骨修復能力[20]。Mao等采用miR-92a-3p轉染人BMSC，使其在BMSC外泌體中高表達，通過miR-92a-3p對wnt5A直接的靶向抑制作用促進軟骨基質蛋白，COL2A1和COMP的表達，抑制MMP13的表達[21]。以上研究為將來EV用于臨床治療提供了進一步的研究方向，通過人為的方式干預EV的作用機制，使其產生更好的治療效果。

5.EV的不同來源及特點

EV的來源廣泛，幾乎可以由所有類型細胞產生，盡管目前較為一致地認為MSC是用于產生EV的最佳細胞源，但是來源于骨髓、脂肪組織、臍帶、滑膜、沃頓氏膠樣組織、胚胎干細胞、誘導型多能干細胞（iPSC）等組織細胞的EV在內容物組成及功能療效等方面也存在差異。

骨髓間充質干細胞（BMSC）目前被認為是MSC治療領域的金標準。已經發現BMSC-EV能夠重新誘導成熟關節軟骨細胞標記物的表達，同時減少分解代謝標記物和炎癥標記物的表達，抑制巨噬細胞活化，誘導M2巨噬細胞表型的產生，從而保護軟骨細胞免于誘導凋亡[22]。但是其在獲取上的較高侵入性、相對較低的增殖潛力以及供體年齡在細胞存活、增殖和分化潛能方面的影響，似乎提示其難以成為最理想的細胞源[23]。

脂肪間充質干細胞（ASC）和BMSC來源的EV似乎表現出相似的治療作用，但ASC-EV的優勢在于其獲取方式上侵入性更小，也更易獲得，有研究發現脂肪組織中有核細胞的1–10%是ASC，而骨髓中BMSC的占比只有0.0001–0.01%[24];其次，ASC本身具有更高的分化潛力以及更長久的離體擴增能力，能夠耐受缺血、缺氧的軟骨微環境引起的細胞凋亡，從而表現出更優越的治療效果[22]。然而，有限的研究發現，不同類型和不同部位的脂肪組織在MSC含量和分化能力上存在差異，而目前來講最佳的獲取部位還需要進一步的研究確認[25]。

胚胎間充質干細胞（ESC-MSC）具有比其他類型MSC更高的自我增殖能力、多項分化能力及更好的抗炎和免疫調節活性，而源于該類MSC的EV則保留了親代細胞的某些優勢[26]。Wang等的研究同樣在動物模型中證明ESC-MSC外泌體可以通過平衡細胞外基質中II型膠原蛋白的合成與基質降解酶的表達阻止OA病變進展[27]。并且有研究觀察到由ESC-MSC-EV治療的軟骨缺損表現出形態良好的透明軟骨生成，與周圍原有的軟骨組織可以完全結合[28]。但是，倫理學上的爭議限制了該類型MSC的廣泛研究。

誘導型多能干細胞（iPSC）則可以由成人或患者自身的各種體細胞經iPS技術誘導形成，避開了胚胎干細胞的倫理限制，這使得iMSC可以更微創的方式獲取，不受來源數量的限制[29]。并且iMSC在細胞增殖，免疫調節，細胞因子譜，調節外泌體的產生以及旁分泌因子的分泌方面更具優勢[30]。Greca等的研究表明和iPSC衍生的EV相比，iMSC分泌的EV富含細胞外基質、細胞基質粘附、運動和細胞運動蛋白，表明其具有更強的組織修復能力[31]。Zhu等比較了來自iMSCs和SMMSCs的外泌體對OA的治療作用，在小鼠膠原酶誘導的OA模型中，iMSC或SMMSC外泌體的關節內注射均可減輕OA，刺激軟骨細胞遷移和增殖，但相比之下iMSC-Exos表現出更顯著的治療效果[32]。

6小結

目前為止，對相關文獻的系統回顧已經證明MSC-EVs在促進OA軟骨細胞遷移和增殖，促進ECM合成，抗分解代謝以及抗炎和免疫調節方面的積極作用。從目前的研究進程來看，EV作為一種細胞間通訊媒介，其中的miRNA和豐富的旁分泌因子起主要作用，但是尚沒有一個相對完整的作用譜系被表征出來。不同來源的EV缺乏在生物學特性及治療效果等方面的系統對比，因此尚無法基于綜合優勢選擇出最佳的EV來源。對EV以某些方式進行預處理確實可以不同程度地增強EV的治療作用，但是目前這方面的研究只是提供了一些方向，由于各種研究在試驗方法及療效標準方面多有不同，因此較難形成統一的證據?？傊?，目前的研究初步明確了EV在用于治療骨關節炎的前景，但是我們還缺乏對其內容物的詳盡了解，尚無法建立起完整的作用機制網絡來闡明其臨床療效與安全性，這需要我們更多進一步的的研究。

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作者簡介：蔡龍云，1993.12，男，漢族，江西會昌人，碩士研究生，研究方向：骨與關節損傷與骨病研究。

通信作者：林宗漢 Email：LZH1965555@163.com