多形擬桿菌菌株的群體感應信號合成酶的檢測及致病機理研究

吳至成 王乙妃 吳琳

摘要：解析一株從臨床病人血液標本里篩查出來的菌株T6000的基因組序列信息，并對其進行群體感應信號合成酶的基因檢測。使用Illumina Miseq測序平臺獲取該菌的全基因組序列，將其全基因組序列經過注釋的基因蛋白質序列提交KEGG數據庫進行BLASTp比對分析，確定該菌潛在的重要感應信號合成酶。結果表明：t6000基因組序列全長6074257 bp，其中GC所占的百分比為42.88%。生物信息學分析結果表明t6000具有13種重要感應信號合成酶及致病機理，為藥物靶位點的確立及新藥的研發奠定理論基礎。

關鍵詞：多形擬桿菌;基因組測序;感應信號基因

厭氧菌在某些特定情況下可由正常菌群變為條件致病菌，約占臨床內源性細菌感染50-60%，其中類桿菌屬細菌分離率最高，常與其他細菌混合感染，造成腹腔內、骨盆及皮膚等感染，有很高的發病率和致死率[1-3]。類桿菌屬有超過20種，以脆弱類桿菌、多形類桿菌、普通類桿菌等在臨床感染最為常見。

群體感應（quorum sensing， QS）是廣泛存在于細菌群體中的依賴細菌密度的信號通訊系統，可通過感知其濃度變化來調節群體行為的現象，如致病菌定植、毒力因子的表達、耐藥性和胞外酶的產生，群集運動，生物膜形成和生物發光等[3，4]。因此，研發類桿菌屬細菌的的QS系統為新型藥物的治療靶點，可更好地控制細菌群體感染及耐藥性的產生，是今后研究的一個重要方向。本研究從臨床血液標本中分離出類桿菌t6000，通過Illumina測序平臺對其全部基因組進行測序，然后使用相關軟件對測序數據進行QS合成酶基因組組裝和編碼基因預測，以期了解t6000的群體感應信號的類型和作用機制。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

t6000是海南醫學院第一附屬醫院臨床病人血液標本里篩查出來的菌株。使用蘇州金唯智生物科技有限公司提供的Buffer1、Buffer2、Buffer3、研磨珠等。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA的提取

取45ml新鮮培養菌液至50ml離心管中， 4000rpm，5-10min，棄上清;將研磨珠倒入上述收集到的菌體沉淀中，加入1.2ml Buffer1，渦旋打散菌體;加入120ul Buffer2，轉速渦旋振蕩10min混勻，加入400ul Buffer3，再次渦旋混勻，冰上靜置10min;4000rpm 10min將上清移至新的2.0mlEP 管中，上清即為粗提的核酸;電泳并送至金唯智NGS實驗室測序。

1.2.2 基因組測、組裝與編碼基因預測

對以上提取保留的基因組DNA通過Illumina HiSeq 2000測序平臺對其全部基因組進行有規律測序，然后使用相關軟件（如cutadapt v1.9.1軟件）對測序數據進行處理和分析，把基因中的接頭序列以及基因的引物去掉，同時也去掉基因中質量在20以內的堿基序列和含量在10%以上的N堿基序列，從而使試驗得到更加穩定、有效的數據（clean data）。

對通過以上試驗測試得出的數據，利用拼接軟件velvet 1. 2. 10 完成序列拼接。采用SSPACE 3.0序列對比軟件對所得到的序列與資源庫中的序列進行對比分析，并且在序列中通過相互之間的關系對其中插入一些序列片段，從而形成了一條新的序列，即scaffold序列。最后再通過GapFiller1-10軟件把gap添加到得到的scaffold序列上，還可以對這條序列進行編輯從而使之得到延伸，就得到了含量在10%以下的N堿基以及質量在20上的堿基序列的scaffold序列，再采用prodigal3.02軟件對基因組進行預測即可。

1.2.3基因功能注釋

通過上述方法得到基因預測的蛋白序列，使用BLAST軟件2.2.31+與基因組百科全書（即KEGG）數據庫進行序列比對（E-value<1e-5），完成基因功能注釋。

2 結果與分析

2.1 基因組裝與編碼基因預測

對基因的序列通過Velvet 1.2.20軟件進行序列拼接試驗（原始的序列19252032個reads，讀長2887804800 bp，插入片段大小350bp），拼接獲得51個contigs，N50大小為329919bp。經過優化與補洞處理后，獲得完整的脆弱擬桿菌株t6000基因組序列，全長6074257 bp，其中GC所占的百分比為42.88%，每一段序列的長度大多數在119103.08bp左右，其中編碼區的基因大約在4796左右，在整條序列的基因組所占90.39%左右，平均長度為1144.87bp。根據菌株t6000含量和reads覆蓋平均深度統計圖可得出（圖1），把基因進行拼接后所得到的GC含量的所占比例大約在30～55%，主要分布的序列深度階段在400～650×的區域之間。

2.2 KEGG數據庫基因注釋分析

KEGG數據庫（即KEGG），基因組信息通過對不同的生物過程進行數據分析和整合可以畫出與之相適合的生物代謝通路圖 [7]。試驗將菌株的所對應的基因序列和KEGG數據庫信息對比分析，結果表明，注釋基因2544個，占基因總數的53.04%，該菌株的編碼基因主要定位在氨基酸生物合成、氨基酸和核苷酸糖代謝和碳代謝等代謝通路。

根據KEGG對該菌株的分析結果可知，195個代謝通路中，其中與群體感應相關的基因包括41個，這些基因組成不同的酶類參與調控細菌t6000群體行為，參與的酶及對應的基因信息見表1。將群體感應基因在通路圖上展示出來，并與目前已報道的感應信號合成酶的基因進行對比，迅速了解大部分感應信號分子的致病機制和代謝途徑，信號通路如下圖2所示。通路圖中，紅色標注的是注釋到的基因[6-20]。

多形類桿菌t 6000 可以編碼13種群體感應合成酶：PhnA、PhnB調控鼠李糖脂的生物合成;Gad A/B、GadC調控耐酸性質;Trb 調控轉運共生質粒;Pel調控角質酶合成;RpfB調控鐵攝取、多重耐藥性及排出有害物質、鞭毛生物合成、Hrp系統、EPS合成、生物膜的形成、胞外酶等多個過程;ToxE、ToxI分別調控毒黃素的生物合成及轉運;CcfA調控接合機制;CylA調控靶細胞裂解;Sec調控降解酶、芽孢形成的基因、毒力、生物膜形成及菌體的衰亡。

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基金：海南省自然科學基金（417146）;

海南省大學生創新創業訓練項目（2017089）

[基金項目]海南省自然基金項目（817324）

[作者簡介]吳至成（1972-），男，海南海口人，副主任檢驗師

[通訊作者]吳琳（1984-），女，海南海口人，副教授