大米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定的不確定度

呂浩宇 田迎迎

摘要：樣品經過提取，經色譜柱分離，流動相梯度洗脫，多反應監測模式進行檢測。考察稱量、標準溶液配制、標準曲線擬合、測量重復性等主要因素引入的不確定度，并對不確定度的各分量進行計算和合成。實驗過程中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的不確定度為0.31μg/kg。

關鍵詞：不確定度;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;大米;高效液相色譜-串聯質譜法

緒論

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是一種真菌毒素，主要由禾谷鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、尖孢鐮刀菌等鐮刀菌產生[1]。該毒素具有較強的細胞毒性和胚胎毒性，也具有一定的致畸致癌性，對免疫系統也有影響，人或畜食用被該毒素污染的糧食或飼料后可能對其健康產生嚴重危害。因此中GB2761-2019中增加了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測限量標準[2，3]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇化學性質穩定，蒸煮及食物加工都不能破壞其毒性，近年來的跟蹤監測檢出率較高，危害性不容忽視。檢測方法主要是（GC-MS）、（HPLC）和（HPLC-MS），HPLC法干擾較多，定性能力不強，GC-MS前處理需要衍生，相較而言，超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC-MS/MS）具有更高分離和抗干擾能力，優勢明顯，應用最為廣泛。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇通過高效液相色譜-串聯質譜法進行檢測[3]，檢測過程中受實驗環境、儀器設備、人員操作等因素的影響，測量會不可避免的引入一定的不確定度[4]。不確定度是利用可獲得的信息，表征賦予被測量量值分散性的非負參數[5]，其數值大小反映了測量結果質量的高低，可用于評價定量分析結果的準確性，為不同測試機構實現數據互認提供參考，因此評定測量不確定度對于保證測量結果的準確性非常重要[6～8]。本研究參考JJF10591.1-2012《測量不確定度評定與表示》、CNAS-GL006《化學分析中不確定度的評估指南》[9]和GB/T27418-2017《測量不確定度評定和表示》[5]等對液質聯用檢測大米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的不確定度進行分析，以期為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的準確檢測提供參考。

一、測試方法簡述

1、提取及凈化

稱取樣品2g（精確至0.001g），用乙腈水溶液提取，渦旋，超聲，離心，取上清液凈化，凈化液用氮氣吹干，乙腈/乙酸銨定容1.00mL，過膜，待液相色譜串聯質譜分析。采用樣品加標實驗評定方法的不確定度。分別吸取樣液進樣，測得其峰面積，代入標準系列的一元線性回歸方程中求得樣液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量。

2、儀器條件

（1）液相色譜條件：

色譜柱：ZORBAXEclipsePlusC183.0*100mm，1.8μm;

流速：0.4mL/min;進樣量：10.0μL;柱溫：40℃;

液相色譜梯度洗脫程序見表2-1。

（2）質譜條件

電離方式：電噴霧離子源，負離子模式ESI-;MRM

毛細管電壓：3.0kV;噴嘴電壓：0.5kV;離子源溫度：100℃;脫溶劑氣及鞘氣：N2;脫溶劑氣溫度：350℃;脫溶劑氣流量：360L/h;脫溶劑氣壓力：40psi;碰撞氣：高純N2;

保留時間、監測離子對、去簇電壓及碰撞能量見表2-2。

3、計算公式

試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量按下式進行計算

二、不確定度的來源分析及測量數學模型的建立

從測量過程和數學模型分析，樣品測定的不確定度來源有：標準溶液配制引入的不確定度urel（C）;標準曲線校準引入的不確定度urel（X0）;樣品稱量引入的不確定度urel（m）;樣品溶液添加、稀釋和定容引入的不確定度urel（V）;結果重復性引入的不確定度urel（frep）。

不確定度數學模型：

三、不確定度評定

1、標準溶液配制引入的不確定度

標準溶液配制包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液的配制和13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇內標溶液的配制，因此標準溶液的相對標準不確定度為：

（1）標準溶液引入的不確定度

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇濃度為200.3±6.2μg/mL、13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇內標溶液濃度為25.0±0.2μg/mL，按正態分布置信概率P=95%，包含因子k=2，

（2）外標溶液配制、稀釋引入的不確定度

標準品配制所使用的10mLA級容量瓶20℃時的容量允差為±0.020mL，服從三角分布，區間半寬度a（V10）=0.020ml*k=，由此引起的標準不確定度u1（V10）=a（V10）/k=0.020/=0.00817，實驗室溫度在（20±5）℃之間變動，甲醇的膨脹系數（20℃）為0.000118/℃，對10ml容量瓶由溫度效應產生的體積變化為10*5*0.000118=0.059ml，服從均勻分布，k=，由此引起的不確定度u2（V10）=a/k=0.59/=0.0341mL，故u（V10）==0.0351，其相對標準不確定度urel（V1）=u（V10）/V10=0.00351。

標準溶液稀釋引入的不確定度：標準溶液稀釋使用200μl移液槍，其容量允差為±2.0μl，服從均勻分布，k=，由此引起的不確定度u1（V200）=a1（V200）/k=2.0/=1.15μL;由溫度效應產生的體積變化分別為200*5*0.00115=1.18μl，服從均勻分布，k=，u2（V200）=1.18/=0.682μl，故稀釋過程中移液槍使用引入的標準不確定度為u（V200）==1.34μL，稀釋過程中用到10mLl容量瓶1次，移液槍50μL（DON）一次，故標準溶液稀釋過程引入的相對標準不確定度為：

由此，標準溶液配制、稀釋過程引入的相對標準不確定度為：

綜上所述，外標溶液引入的相對標準不確定度為：

相關結果見表3-1。

（3）內標物引入的不確定度

內標物濃度引入的不確定度：內標溶液配制、稀釋、添加引入的不確定度計算與外標的計算方法相同，其值為urel（V1）=u（V10）/V10=0.00351;實驗過程中內標溶液的添加是用200μL移液槍（2次），故內標溶液稀釋引入的不確定為urel（V2）==0.010，實驗過程中，內標溶液的添加使用200μl移液槍，移液槍引入的標準不確定度為urel（V200）=1.35μL，樣品前處理過程中內標溶液移取體積為20μL，故內標溶液添加引入的相對標準不確定度為urel（V3）=1.35/20=0.0675。由此內標配制、稀釋、添加過程引入的相對標準不確定度為urel（V）===0.0683，故13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇內標溶液引入的相對標準不確定度為urel（Cistd）==0.0684。

2、最小二乘法擬合引入的不確定度

試驗中，配制6個濃度的校準溶液：1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，20.0ng/mL，50.0ng/mL（其中含內標物13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇濃度均為10.0ng/mL），外標與內標的質量濃度比X0分別為0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00的6個標準溶液測定一次，得到內外標峰面積比值y，對以上測定數據采用最小二乘法進行擬合，得到校準曲線方程y=ax+b和擬合系數r2，相關結果見表3-2。

為了評定最小二乘法估計量的不確定度，首先必須對直接測量所得的測量數據進行不確定度評估，實際上就是求出測量數據的實驗標準差：

公式中為當輸入量為xj時，儀器響應值與擬合直線上對應的相應值之差。

在用間接式測量儀器測量時，利用校準曲線，在測量樣品響應值y0后，可以按照線性回歸方程計算被測量的預估值x0，其標準不確定度u（x0）為：

公式中s（y）為校準溶液峰面積比殘差的標準偏差，b為擬合直線的斜率，p為樣品平行測量的次數（p=6），n為擬合直線的數據總數（n=6），x0為樣品平行測量p次結果的平均值，為繪制擬合直線全部輸入值xi的總平局值，urel（x0）=u（x0）/x0，計算結果見表3-5。

3、樣品稱樣量引入的不確定度

樣品稱樣量使用萬分之一天平準確稱取，天平最大允許誤差為±0.1mg，按均勻分布考慮，包含因子k=，不確定度為urel（m）=0.0001/=0.000003。

樣品溶液添加、稀釋和樣品定容引入的不確定度：

樣品溶液添加引入：實驗過程中提取液的添加使用10ml移液器，根據JJG646-2006的規定，容量允差為±0.6%，服從均勻分布，k=，u1（V10）=10000a（V10）/k=0.00346ml，由溫度效應產生的體積變化為10*5*0.00137=0.0685ml，服從均勻分布u2（V10）=0.0395ml，即urel（V1）=/10=0.00397。

樣品溶液稀釋引入的不確定度：實驗過程中，氮吹濃縮5ml樣品溶液使用10ml移液器，容量允差為±0.6%，服從均勻分布，k=，u1（V10）=5000a（V10）/k=0.00173ml，由溫度效應產生的體積變化為5*5*0.00137=0.0342ml，服從均勻分布u2（V10）=0.0197ml，即urel（V2）=/5=0.00685。

定容體積引入的不確定度：樣品定容使用1ml移液器，容量允許差為±1.0%，服從均勻分布，u1（V1000）=1000*1.0%/=5.774μl，實驗室溫度引起的體積變化可以忽略不計，故urel（V3）=5.774/1000=0.00577。

綜上所述，樣品溶液添加、稀釋和定容引入的不確定度為urel（V）==0.00980。

結果重復性引入的不確定度：在重復性條件下對4ng進行了6次獨立測試，平行測試結果和平均值見表3-6，根據貝塞爾公式計算的單次測量的標準不確定度：u（X）=s（X）=（3-8）

以多次測量結果的算術平均值為最佳估算值，則測定結果的標準不確定度為：u（）=s（）/（3-9）

由此結果重復性引入的相對標準不確定度：

結果見下表。

4、樣品合成標準不確定度

樣品中目標化合物的相對標準不確定度為：

合成標準不確定度u（x）=x*urel，取包含因子k=2，置信概率p=95%，則擴展不確定度為U（x）=k*u（x）。

四?結論

本文采用液相色譜串聯質譜法對大米中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行測定，比較各分量不確定度的大小發現實驗過程中標準溶液的配制帶來的不確定度影響最大。該方法準確可靠，整個實驗過程中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的不確定度分別為0.31μg/kg，為檢測過程中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測結果的準確性提高提供技術指導。

參考文獻

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