不同檢測(cè)方法在丙型病毒性肝炎診斷中的應(yīng)用

劉麗花 徐昕

丙型肝炎病毒（hepatitis virus C，HCV）是單股正鏈RNA病毒，主要經(jīng)血和血制品傳播。據(jù)流行病學(xué)分析，2015年全球HCV的感染率為2.8%，呈逐年上升趨勢(shì)[1]。丙型肝炎潛伏期與病程均較長(zhǎng)，病情發(fā)展較為緩慢，疾病后期會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝臟慢性纖維化或者炎癥壞死等并發(fā)癥，由于HCV的病毒特性，患者感染病毒病程少見自限性痊愈，多遷延性發(fā)展為慢性丙型肝炎，10～20年之后發(fā)展為肝硬化，肝細(xì)胞肝癌，對(duì)患者生命安全造成威脅[2]。另外，丙型肝炎患者會(huì)由于肝細(xì)胞癌或者肝衰竭導(dǎo)致死亡，臨床尚無(wú)有效的預(yù)防與治療方法，需要通過(guò)早期檢測(cè)與干預(yù)來(lái)改善患者預(yù)后[3]。臨床檢測(cè)丙型病毒性肝炎所采用的方法主要有酶聯(lián)免疫法、磁微粒化學(xué)發(fā)光法、膠體金法及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），對(duì)丙型肝炎病毒核糖核酸（hepatitis C virus-ribonucleic acid，HCV-RNA）載量與HCV抗體進(jìn)行綜合檢測(cè)可對(duì)慢性丙型肝炎的感染情況進(jìn)行明確，同時(shí)還可對(duì)病毒的復(fù)制情況進(jìn)行判斷。HCV感染的病原學(xué)檢測(cè)是確定和治療決策的重要依據(jù)，本次研究旨在探討不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法在丙型病毒性肝炎臨床診斷中的應(yīng)用，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2018年1月—2020年1月臨床診斷為丙型肝炎的患者100例，其中65例男性，35例女性；年齡最小25歲，最大76歲，平均年齡（50.52±6.53）歲；病程范圍0.3～1.2年，平均病程（0.75±0.25）年。詳見表1。臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《丙型肝炎防治指南（2015更新版）》[4]，所有入組患者均抽取靜脈血3～5 mL，常規(guī)分離血清后分裝保存于-20℃以下冰箱待冷凍保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)患者同意，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均簽署知情同意書；（2）均無(wú)肝炎史；（3）均存在厭油及右上腹部不適癥狀；（4）均具有完整的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他肝部疾病者；（2）依從性較低者；（3）存在意識(shí)障礙及認(rèn)知障礙者；（4）存在精神障礙者。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫法 采用Microlab STRA IVD酶免儀（瑞士澳斯邦生物工程有限公司，ELISA Star 8ch）其配套試劑進(jìn)行檢測(cè)，采用間接法原理檢測(cè)人血清中的丙型肝炎病毒抗體。樣本A值＜臨界值（cut off）為丙型肝炎病毒-免疫球蛋白G（hepatitis virus C-immunoglobulin G，HCV-IgG）陰性，樣本A值≥臨界值（cut off）為HCV-IgG陽(yáng)性。

1.2.2 磁微粒化學(xué)發(fā)光法 采用AutoLumo A2000 Plus全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀（鄭州安圖生物工程股份有限公司）以及全套試劑，所有操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行，待測(cè)樣本發(fā)光值＜cut off值時(shí)，檢測(cè)呈陰性反應(yīng)，待測(cè)樣本發(fā)光值≥cut off值時(shí)，檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)，cut off值=陽(yáng)性對(duì)照孔平均值×0.4。

1.2.3 膠體金法 采用膠體金免疫層析技術(shù)，應(yīng)用間接法原理測(cè)定人血清中HCV抗體，15 min內(nèi)觀察結(jié)果。HCV顯示陽(yáng)性：試紙卡在檢測(cè)線（T）和對(duì)照線（C）位置出現(xiàn)兩條紫紅色條帶，陰性：試紙卡只在對(duì)照線（C）位置出現(xiàn)一條紫紅色條帶。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用QIAamp Viral RNA miniKit核酸提取試劑盒提取病毒核酸，采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的HCV-RNA FQ-PCR試劑盒在ABI 7500儀器（美國(guó)羅氏公司，Light Cycler 480Ⅱ）進(jìn)行檢測(cè)，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書及設(shè)備進(jìn)行，將定量結(jié)果≥1×103IU/mL判定為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x-±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

磁微粒化學(xué)發(fā)光法陽(yáng)性率為99.00%，酶聯(lián)免疫法陽(yáng)性率為98.00%，略高于膠體金的94.00%，但三種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的陽(yáng)性率為53.00%（53/100），主要用于檢測(cè)病毒載量。

表1 不同檢驗(yàn)方法的檢驗(yàn)結(jié)果比較[例（%）]

3 討論

丙型肝炎是由HCV感染引起的一系列肝功能異常、損傷、甚至肝癌的一類傳染性疾病，發(fā)病率較高且逐年上升，對(duì)患者身體健康有嚴(yán)重影響，甚至威脅到其生命安全，已成為非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[5]。丙型肝炎的病程相對(duì)較長(zhǎng)且轉(zhuǎn)陰率較低，目前對(duì)丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制并不十分明確。有研究認(rèn)為HCV的直接損傷是急性丙型肝炎的主要病因，宿主免疫的損傷作用可能與慢性丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，特異性體液免疫及細(xì)胞免疫可能發(fā)揮了重要作用[6]。患者發(fā)病早期無(wú)明顯癥狀，也未出現(xiàn)相關(guān)不適感，極易被忽視，患者甚至不愿意入院接受檢查，隨著病情進(jìn)展患者病情逐漸加重，導(dǎo)致其錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間，增大治療難度，一旦漏診或者誤診會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝硬化與肝癌等惡性并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致患者死亡[7]。當(dāng)前尚無(wú)治療丙型肝炎的特效疫苗或者方式，在早期預(yù)防方面存在較大難度，由于該病具有傳染性，盡早實(shí)施有效診斷可降低發(fā)病率，控制病情進(jìn)展，改善患者預(yù)后，因此早期診斷對(duì)疾病治療意義重大[8]。

丙型肝炎主要由丙型肝炎病毒所導(dǎo)致，病毒進(jìn)入人體之后會(huì)出現(xiàn)病毒血癥，丙型肝炎病毒還會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)大分子的合成造成干擾，導(dǎo)致溶酶體膜通透性發(fā)生變化，引起細(xì)胞病變。就肝細(xì)胞來(lái)說(shuō)，丙型肝炎病毒表達(dá)物所產(chǎn)生的毒性作用不但會(huì)損傷患者肝臟，還會(huì)損害其他臟器功能。臨床尚無(wú)預(yù)防丙型肝炎的有效疫苗，健康人群可通過(guò)體檢篩查來(lái)預(yù)防疾病發(fā)生，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并且及時(shí)治療，進(jìn)而有效預(yù)防疾病的發(fā)生。對(duì)丙型肝炎的診斷首先需要對(duì)抗-HCV抗體及HCV核糖核酸等標(biāo)志物進(jìn)行檢驗(yàn)，若以上標(biāo)志物的檢驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，可將其確診為丙型肝炎。另外，還要通過(guò)肝臟功能的超聲檢驗(yàn)與生化檢驗(yàn)等方式與診斷標(biāo)準(zhǔn)相結(jié)合，進(jìn)而確定丙型肝炎。丙型肝炎的傳染源較為復(fù)雜，主要為無(wú)癥狀亞臨床患者、急性臨床患者、慢性患者與病毒攜帶者，一般情況下，患者在發(fā)病前12 d其血液就存在感染性，并且病毒可攜帶12年以上，主要傳播途徑為血源傳播，國(guó)外輸血之后確診為丙型肝炎的人數(shù)在30%～90%之間，我國(guó)輸血之后確診為丙型肝炎的患者在所有肝炎人群中占有1/3，其他傳播方式如家庭日常接觸傳播、母嬰垂直傳播及性傳播。輸入含有HCV-RNA或者HCV的血液制品或者血漿之后，一般情況下需要經(jīng)過(guò)6～7周的潛伏期后可急性發(fā)病，患者主要臨床表現(xiàn)為肝區(qū)不適、全身無(wú)力及胃納差，約1/3患者會(huì)出現(xiàn)黃疸、ALT升高及抗HCV抗體陽(yáng)性，大約50%的丙型肝炎患者會(huì)逐漸發(fā)展為慢性肝炎，部分患者甚至?xí)l(fā)展為肝硬化與肝細(xì)胞癌，半數(shù)患者屬于自限性，可自動(dòng)康復(fù)。該病的發(fā)病機(jī)理尚未完全清楚，HCV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制會(huì)對(duì)肝細(xì)胞蛋白的合成造成干擾，甚至?xí)?dǎo)致肝細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死，可見HCV會(huì)對(duì)患者肝臟造成直接損害，對(duì)于疾病的發(fā)生有促進(jìn)作用。患者一旦感染HCV，產(chǎn)生的保護(hù)性免疫力相對(duì)較差，在急性感染之后血液中首先發(fā)現(xiàn)HCV-RNA，之后才會(huì)發(fā)現(xiàn)抗HCV，并且最早對(duì)HCV-RNA的檢出時(shí)間為暴露后2周。

完善的病原學(xué)檢測(cè)是慢性HCV感染篩查、監(jiān)測(cè)、診斷和治療的基礎(chǔ)。酶聯(lián)免疫法是臨床應(yīng)用廣泛的丙型肝炎檢測(cè)方法，也是應(yīng)用最早的檢測(cè)方法，主要通過(guò)酶催化且放大反應(yīng)效果的方式進(jìn)行檢測(cè)，雖然陽(yáng)性率較高，但操作較為繁瑣，需要進(jìn)行批量檢測(cè)，所花費(fèi)的資金較多。在醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展的情況下，新的檢測(cè)技術(shù)在臨床廣泛應(yīng)用，相對(duì)于酶聯(lián)免疫法這種操作復(fù)雜且價(jià)格昂貴的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，研究人員更傾向于簡(jiǎn)單、便捷且高效的檢測(cè)方法[9-10]。磁微粒化學(xué)發(fā)光法是先進(jìn)的技術(shù)手段，所用時(shí)間較短，可自動(dòng)進(jìn)行稀釋并重新檢測(cè)，準(zhǔn)確率較高。膠體金法在丙型肝炎的檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，主要將抗體與抗原之間的反應(yīng)通過(guò)層析法進(jìn)行檢測(cè)，采用膠體金判斷陽(yáng)性與陰性可使得檢測(cè)準(zhǔn)確率不斷提高，漏診率與誤診率不斷降低，并且該種檢測(cè)方式操作簡(jiǎn)便快捷，不需要特殊設(shè)備即可完成檢驗(yàn)，可用于初步診斷，對(duì)丙型肝炎的預(yù)防與控制方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值[11-12]。熒光定量PCR法是近年發(fā)展的生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，主要是在常規(guī)的PCR技術(shù)中應(yīng)用熒光探針或者熒光染料，然后通過(guò)累積的熒光信號(hào)對(duì)整個(gè)PCR過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，之后對(duì)其進(jìn)行定量分析，可很好的彌補(bǔ)其他檢測(cè)方式存在的弊端，定量準(zhǔn)確率高可真實(shí)反映HCV的復(fù)制情況，但檢查繁瑣且費(fèi)用昂貴。研究中酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)陽(yáng)性率為98.00%，磁微粒化學(xué)發(fā)光法的檢測(cè)陽(yáng)性率為99.00%，兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)陽(yáng)性率之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明對(duì)丙型肝炎的檢測(cè)均有顯著的臨床效果。膠體金法的檢測(cè)陽(yáng)性率為94.00%，主要用于初篩實(shí)驗(yàn)[13]。三種方法之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的檢測(cè)陽(yáng)性率為53.00%，現(xiàn)主要用于已確診的HCV感染患者的病毒載量。

HCV-IgG是反映是否感染過(guò)HCV的指標(biāo)，對(duì)慢性肝炎的診斷有重要意義。HCV-RNA是HCV感染的直接證據(jù)，為確診丙型肝炎，監(jiān)測(cè)病毒水平，確定治療方案和抗病毒療效觀察提供依據(jù)。

綜上所述，綜合檢測(cè)HCV抗體和HCV-RNA載量可以明確診斷慢性丙型肝炎感染和判斷病毒復(fù)制情況。