肝硬化合并肝性腦病患者血清代謝產(chǎn)物水平分析

李立峰，胡公義，侯若南，吳 和，齊艷紅

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1.急診醫(yī)學(xué)科；2.全科醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325000)

肝性腦病(hepatic encephalopathy, HE)是一種由于急、慢性肝功能嚴(yán)重障礙或各種門(mén)靜脈-體循環(huán)分流異常所致的，以代謝紊亂為基礎(chǔ)的，輕重程度不同的神經(jīng)精神異常綜合征。HE是肝硬化患者嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是肝硬化患者死亡的常見(jiàn)原因之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國(guó)外肝硬化患者HE發(fā)生率高達(dá)30%～45%[2]，國(guó)內(nèi)肝硬化患者HE發(fā)生率為10%～50%，概率隨肝功能損害程度加重而升高。肝硬化患者并發(fā)HE后，若救治不及時(shí)死亡率極高，有文獻(xiàn)[3]報(bào)道其1年存活率低于50%，3年存活率低于25%。早期快速診斷、科學(xué)客觀評(píng)估病情有助于準(zhǔn)確判斷肝硬化并發(fā)肝性腦病患者的預(yù)后，提高肝性腦病患者的救治成功率。當(dāng)前尚缺乏對(duì)肝性腦病診斷和評(píng)估的有效實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，本研究通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)，采用主成分分析法和最小二乘法判別分析對(duì)肝性腦病患者血清代謝成分進(jìn)行分析，結(jié)合生化指標(biāo)檢測(cè)等手段，尋找診斷和評(píng)估病情的特征性代謝產(chǎn)物，為臨床肝性腦病的診斷和治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1 月—2019年12月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診留觀的肝硬化合并肝性腦病患者18例，男12例，女6例，平均年齡(55.3±10.5)歲。同時(shí)選取肝硬化未合并肝性腦病的53例患者作為肝硬化對(duì)照組，男35例，女18例，平均年齡(54.1±11.1)歲。兩組患者性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對(duì)象由本人或代理人簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 肝硬化的納入標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社第八版《內(nèi)科學(xué)》[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)有乙肝肝硬化或酒精性肝硬化病史；(2)有肝功能減退和門(mén)靜脈高壓的臨床表現(xiàn)；(3)有血漿白蛋白下降、總膽紅素升高、凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)等異常指標(biāo)，提示肝功能失代償期；(4)超聲或影像學(xué)結(jié)果提示肝硬化，內(nèi)鏡結(jié)果提示胃底食管靜脈曲張。肝組織活檢見(jiàn)假小葉的形成是診斷肝硬化的金標(biāo)準(zhǔn)。肝性腦病的納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：(1)有嚴(yán)重肝病或廣泛門(mén)-體分流的基礎(chǔ)；(2)意識(shí)障礙、智力異常、精神紊亂，可引出撲翼樣震顫(+)；(3)有明確 HE 誘因；(4)反映肝功能損害的生化指標(biāo)明顯異常或血氨明顯增高；(5)腦電圖典型改變有重要參考價(jià)值。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有神經(jīng)系統(tǒng)疾病；(2)器官移植術(shù)后；(3)惡性腫瘤；(4)妊娠；(5)HIV感染。

1.3 UPLC-MS/MS分析 入院6 h內(nèi)，經(jīng)靜脈穿刺術(shù)采集患者全血，離心取血清(3 000 r/min離心10 min，離心半徑13.5cm)。100 μL血清樣品加300 μL乙腈，渦旋混合1 min，4℃ 13 000 r/min(離心半徑13.5cm) 離心10 min。取150 μL上清液于進(jìn)樣瓶的內(nèi)襯管中，取2 μL注入U(xiǎn)PLC-MS/MS分析。采用ACQUITY UPLC和XEVO TQS-micro三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Waters公司，美國(guó))，UPLC HSS C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱分離，柱溫為40℃。采集的血漿供HPLC-MS檢測(cè)，優(yōu)化色譜條件使色譜峰充分分離，標(biāo)記信噪比>10的色譜峰并進(jìn)行峰面積積分。

1.4 常規(guī)生化分析 采用全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)檢測(cè)患者血清白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板(PLT)、INR、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Sr)，白蛋白(Alb)和血氨等生化指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)生化指標(biāo)水平比較 與肝硬化對(duì)照組比較，肝性腦病組患者血氨水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組間WBC、Hb、PLT、INR、ALT、Sr、Alb水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者常規(guī)生化指標(biāo)水平比較

2.2 血清代謝產(chǎn)物水平比較 與肝硬化對(duì)照組比較，肝性腦病組患者血清中乙酰半胱氨酸、乙酰氨基、4-乙酰氨基丁酸、L-苯乙酰谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、奎寧酸、阿拉伯醇、乙酰肉堿和犬尿氨酸水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者血清代謝產(chǎn)物水平比較

3 討論

目前，肝性腦病早期診斷和病情評(píng)估主要依據(jù)患者臨床表現(xiàn)，神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試，影像學(xué)檢查及肝功能、血氨等實(shí)驗(yàn)室檢查。當(dāng)前尚缺乏對(duì)肝性腦病準(zhǔn)確診斷和評(píng)估的方法和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，常規(guī)生化指標(biāo)中僅血氨水平肝性腦病患者比肝硬化組明顯升高，其他常規(guī)生化檢測(cè)指標(biāo)無(wú)明顯差異。UPLC-MS/MS檢測(cè)能夠高效、靈敏、準(zhǔn)確地探索分析未知化合物，目前廣泛應(yīng)用于生物代謝組學(xué)研究[6-8]。本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)兩組患者血清成分，共檢測(cè)出20種代謝物，與肝硬化組比較，肝性腦病組患者血清中乙酰半胱氨酸、乙酰氨基、4-乙酰氨基丁酸、L-苯乙酰谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、奎寧酸、阿拉伯醇、乙酰肉堿和犬尿氨酸水平明顯升高。

本研究結(jié)果顯示，乙酰化代謝產(chǎn)物明顯增加(乙酰半胱氨酸、乙酰氨基、4-乙酰氨基丁酸、L-苯乙酰谷氨酰胺)，可能是由于高血氨影響三羧酸循環(huán)代謝，導(dǎo)致丙酮酸氧化β-氧化途徑代償性增加，產(chǎn)生大量的乙酰輔酶A，進(jìn)而導(dǎo)致乙酰化代謝產(chǎn)物的增加，提示肝性腦病患者體內(nèi)發(fā)生能量代謝改變。目前，有關(guān)肝性腦病能量代謝的變化主要通過(guò)動(dòng)物或細(xì)胞水平進(jìn)行研究[9]。Weiss等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肝性腦病患者腦脊液中三羧酸循環(huán)中間體的水平?jīng)]有變化，但丙酮酸、酰肉堿和乙酰化化合物的水平增加。肉堿和酰肉堿水平的急劇增加可能反映了三羧酸循環(huán)活性的降低，可能與脂肪酸β-氧化途徑的代償性增加有關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)肉堿類代謝產(chǎn)物增加，肉堿類代謝產(chǎn)物是脂肪酸代謝途徑的產(chǎn)物，進(jìn)一步說(shuō)明肝性腦病患者體內(nèi)脂肪酸氧化途徑激活可能與體內(nèi)三羧酸能量代謝途徑被抑制而導(dǎo)致其他能量代謝途徑代償性增加有關(guān)。本研究結(jié)果顯示肝性腦病組患者乙酰肉堿水平明顯增加，而其他肉堿類代謝物水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前，肝硬化患者中肉堿和酰基肉堿水平的研究存在一定的爭(zhēng)議。Tang等[11]觀察到隨著原發(fā)性膽汁性肝硬化的發(fā)展，肉堿(如丙酰肉堿和丁酰肉堿)水平逐漸下降。然而，亦有文獻(xiàn)[12]報(bào)道肝硬化患者血漿中的酰基肉堿水平升高，而肉堿水平未改變。而有文獻(xiàn)[13]報(bào)道肉堿和乙酰肉堿可預(yù)防高氨血癥，并可改善高血氨對(duì)患者的毒性作用，尤其是對(duì)肝硬化患者[14]和肝性腦病患者[15]。

本研究結(jié)果還顯示，苯丙氨酸、奎寧酸、阿拉伯醇和犬尿氨酸在肝性腦病組患者中明顯增加，提示苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝以及醇類代謝等途徑在肝性腦病患者中均顯著增強(qiáng)。Dabos等[16]采用核磁共振譜(nuclear magnetic resonance, NMR)的代謝組學(xué)研究將肝硬化患者與肝性腦病患者進(jìn)行區(qū)分，基于酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丙酮酸和甘氨酸代謝物特征區(qū)分肝性腦病患者和肝硬化患者，與本研究的部分代謝產(chǎn)物相類似，提示血清酪氨酸、苯丙氨酸等代謝物對(duì)識(shí)別肝硬化患者是否合并肝性腦病具有重要意義。肝性腦病患者往往存在芳香族氨基酸/支鏈氨基酸比例失調(diào)，支鏈氨基酸水平降低導(dǎo)致過(guò)多的酪氨酸、苯丙氨酸等代謝產(chǎn)物進(jìn)入大腦，產(chǎn)生假神經(jīng)遞質(zhì)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)傳導(dǎo)異常，最終出現(xiàn)意識(shí)障礙或昏迷，這也是肝性腦病患者出現(xiàn)認(rèn)知障礙的重要原因。

綜上所述，合并與未合并肝性腦病肝硬化患者具有相似的代謝障礙，提示肝性腦病和肝硬化具有相類似的病理生理機(jī)制，肝性腦病是肝硬化更為嚴(yán)重的階段。本研究通過(guò)UPLC-MS/MS檢測(cè)肝性腦病和肝硬化患者血液代謝產(chǎn)物變化，研究結(jié)果對(duì)肝性腦病的臨床診斷及治療具有一定的意義。