miR-138調控Notch-1信號通路對腦膠質瘤細胞增殖與分化作用及其機制研究

呂 堯，戴偉民，揭園慶，余國峰

(衢州市人民醫院 神經外科，浙江 衢州 324000)

腦膠質瘤是常見的顱內惡性腫瘤，主要治療方式包括外科手術和放化療[1-2]。微小RNA(micro RNA， miRNA)可調控蛋白編碼，影響蛋白表達，在許多信號通路中起到關鍵作用[3]。近年來研究發現miRNAs在腦膠質瘤患者和腦組織正常人群中的表達具有差異性。李會兵等[4]認為miR-138異常表達可影響腦膠質瘤細胞增殖、侵襲以及凋亡，梁燕等[5]認為Notch-1信號通路活化可促進腦膠質瘤細胞增殖與分化。本研究觀察腦膠質瘤患者miR-138和Notch-1信號通路相關蛋白表達情況，觀察miR-138表達水平對人腦膠質瘤細胞株U-87 MG Notch-1信號通路相關蛋白表達的影響，探討miR-138在腦膠質瘤中的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 試劑與材料 人腦膠質瘤細胞株U-87 MG購自上海素爾生物科技有限公司，miR-138轉染試劑購自上海吉瑪公司，Trizol試劑、PVDF膜、U6內參檢測試劑盒購自Invitrogen公司，2 000 bp DNA marker購自鄭州實驗器材有限公司，牛血清蛋白(BSA)購自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)、CCK 8試劑盒購自Gibco公司，miRNA熒光定量PCR試劑盒購自Stratagene Crop公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，高速離心機購自德國Eppendrof公司，熒光定量PCR儀(7500Fast)購自美國ABI公司。

1.2 研究對象一般資料 2018年1月—2019年1月于衢州市人民醫院收集18例鑒定為腦膠質瘤患者的腦組織活檢標本和5例神經外科腦外傷手術患者的正常腦組織活檢標本，采集標本前均獲得患者或家屬知情同意，本研究獲得醫院倫理委員會批準。腦膠質瘤患者平均年齡(52.33±13.42)歲，男12例、女6例， WHO分級：I級5例、Ⅱ級6例、Ⅲ級7例，病理學類型：星形細胞瘤11例、間變少突膠質細胞瘤4例、間變星形細胞瘤3例。腦膠質瘤患者納入標準：符合腦腫瘤診斷標準[6]，病理檢查確診為腦膠質瘤，臨床資料完整；排除合并其他腫瘤疾病及精神疾病、抑郁癥等與腦部相關的疾病患者。5例腦外傷手術患者平均年齡(52.41±12.78)歲，男3例、女2例。腦組織取出后用生理鹽水沖洗干凈，置于液氮中迅速冷凍保存備用。

1.3 組織miR-138表達水平檢測 取出組織標本，在液氮預冷研缽里研磨，利用Trizol法提取組織總RNA，逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件為16℃ 5 min、42℃ 45 min、85℃ 5 min和10℃停止。利用熒光定量PCR檢測腦組織miR-138表達水平，每例標本設3個復孔，94 ℃作用3 min，94℃ 作用20 s，反應40個循環；62℃作用40 s，反應40個循環。結果采用2-ΔΔCt法計算。

1.4 細胞培養與轉染 人腦膠質瘤細胞株U-87 MG用含10%胎牛血清和90%RPMI-1640培養基，在37℃、5% CO2條件下培養，取對數生長期的細胞以1.5×105個/孔接種于細胞培養6孔板中。實驗分為Mimics組、Inhibitor組、Blank組，Mimics組細胞轉染脂質體復合物和miR-138 mimics，Inhibitor組細胞轉染脂質體復合物和miR-138 inhibitor，Blank組只加脂質體。按照Trizol說明書提取細胞總RNA，逆轉錄成cRNA后，采用熒光定量PCR檢測miR-138表達水平。

1.5 Western Blot法 檢測Notch-1信號通路相關蛋白Notch-1和Hes-1的表達，組織和細胞提取的蛋白按BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，與TBST按1∶200稀釋一抗，室溫封閉2 h。洗膜后加入與TBST按1∶4 000稀釋二抗，室溫孵育1 h；化學發光、顯影、定影，掃描膠片，結果用Image Pro Plus 6.0 分析目標條帶的積分光密度(IOD)值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白IOD值/內參IOD值。

1.6 半定量PCR法 檢測Notch1 mRNA和Hes1 mRNA水平，用Trizol法提取組織和細胞總RNA，按RT-PCR 試劑盒說明書步驟將總RNA逆轉錄成cDNA，以PCR產物量作為衡量相應基因表達水平的半定量指標，用電泳凝膠置于凝膠圖像分析系統(quantity-one分析軟件)行半定量分析，計算所得產物的積分光密度與各自內參照積分光密度的比值表示mRNA相對表達量。

1.7 細胞增殖實驗 96孔培養板中分別接種2×103個/孔的Mimics組、Inhibitor組和Blank組轉染細胞，每組設3個復孔。培養24 h后棄去培養基，分別加200 μL細胞培養基和10 μL CCK溶液置于二氧化碳培養箱培養4 h。各組轉染細胞測定450 nm波長吸光度值，24 h/次，連續3次，繪制生長曲線。

1.8 細胞分化實驗 細胞轉染16 h后，換含10% FBS培養基對各組細胞進行誘導分化，以WST-8法[7]測定培養0、3、5、7 d的活細胞數，根據活細胞的增殖數目判斷各組細胞的分化能力。

1.9 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件，2組間計量資料比較采用t檢驗，3組及3組以上組間計量資料比較單因素方差分析；方差齊時兩兩比較進行LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett T3檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織miR-138表達水平 miR-138表達水平在不同WHO分級和病理類型的腦膠質瘤組織中的差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 腦膠質瘤組織和正常腦組織miR-138表達水平比較

表1(續)

2.2 組織Notch-1和Hes-1表達水平 與正常腦組織比較，病理類型為星形細胞瘤、間變少突膠質細胞瘤和間變星形細胞瘤的Notch-1蛋白、Hes-1蛋白、Notch-1 mRNA和Hes-1 mRNA相對表達量均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 腦膠質瘤組織和正常腦組織的Notch-1和Hes-1表達水平比較

2.3 腦膠質瘤細胞株U-87 MG miR-138、Notch-1和Hes-1表達水平 腦膠質瘤細胞株U-87 MG Blank組、Mimics組、Inhibitor組的miR-138 相對表達量分別為0.63±0.02、0.92±0.05、0.46±0.05，差異具有統計學意義(F=101.966，P<0.001)。3組間Notch-1蛋白、Hes-1蛋白、Notch-1 mRNA和Hes-1 mRNA的相對表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中Mimics組相對表達量最低，Inhibitor組相對表達量最高。見表3。

表3 腦膠質瘤細胞株U-87 MG Notch-1和Hes-1表達水平

2.4 腦膠質瘤細胞株U-87 MG體外增殖情況 CCK8實驗結果顯示，在24、48、72 h時與Blank組比較，Mimics組450 nm波長吸光度值均下降，Inhibitor組450 nm波長下吸光度值均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：*與Blank組比較，P<0.05。

2.5 腦膠質瘤細胞株U-87 MG體外分化情況 WST-8檢測結果顯示，在3、5、7 d與Blank組的活細胞數比較，Mimics組的活細胞數均降低，Inhibitor組均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：*與Blank組比較，P<0.05。

3 討論

腦膠質瘤是以細胞異質性、快速增殖、血管生成、廣泛性侵襲、缺氧和壞死為主要特點[8]。研究[9]顯示，miRNA在腦膠質瘤的診斷、化療藥物療效的評估、抗血管生成、治療及預后判斷等方面具有重要的臨床意義。miRNA是一種內源性非編碼小分子RNA，可以特異性結合靶基因mRNA的非編碼區，調控蛋白質編碼基因而影響生物學功能[10]。已發現上千種miRNA參與調控人體內基因的表達，miRNA參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學過程，不同疾病、不同組織部位或同種疾病不同病變程度miRNA表達水平不同，因此miRNA可作為某些疾病或病變程度的預測物，如miRNA可預測結腸癌預后情況[11]，血清miRNA-21可預測腎癌臨床病理特征的關系以及術后復發情況[12-13]。miR-138包括位于人類3號染色體(Ch3p21.32)的miR-138-1和16號染色體(Ch16q13)的miR-138-2，廣泛表達于機體組織中[14]。miR-138在多種腫瘤疾病中呈低表達[15-16]。Notch信號是一組跨膜受體，由Notch受體、配體、Notch調節分子和其他的效應物組成，細胞之間相互作用可產生Notch信號激活Notch通路。Notch-1是Notch其中一種跨膜受體，影響細胞的生長發育、增殖分化，促進腫瘤或抑制腫瘤生成[17-18]。研究[19]證實，Notch-1信號通路在膠質瘤中充當重要角色，Notch-1信號通路影響膠質瘤的發生發展。

本研究結果顯示，腦膠質瘤患者的miR-138表達水平在WHO分級與病理類型分型中存在差異，且WHO分級Ⅱ級、Ⅲ級以及病理類型為星形細胞瘤、間變少突膠質細胞瘤和間變星形細胞瘤的miR-138表達水平明顯降低。進一步檢測組織中Notch-1信號通路相關蛋白水平發現，與正常腦組織相比，病理類型為星形細胞瘤、間變少突膠質細胞瘤和間變星形細胞瘤的腦膠質瘤組織的Notch-1和Hes-1表達水平明顯增高，提示Notch-1信號通路活化與腦膠質瘤患者發生相關。人腦膠質瘤細胞株U-87 MG轉染miR-138 mimics后，miR-138相對表達量升高，Notch-1信號通路相關蛋白Notch-1和Hes-1表達水平降低，細胞增殖和分化作用下降；轉染inhibitor后，miR-138相對表達量降低，Notch-1和Hes-1表達水平升高，細胞增殖和分化作用增強；推測miR-138可能通過負向調控Notch-1信號通路抑制腫瘤細胞增殖和分化。

綜上，不同WHO分級與病理類型分型的腦膠質瘤患者的miR-138水平在存在差異，miR-138可能通過負向調控Notch-1信號通路抑制腦膠質瘤細胞U-87 MG增殖和分化，后續仍需進行大樣本研究或動物實驗驗證。