原發性肝癌組織中miR-557的表達及其與預后的關系

陳緒林 姜 宇 趙 艷 李彩華 高逸之

原發性肝癌(PLC)是一種常見的惡性腫瘤[1]。在中國PLC的發病率和病死率均較高，嚴重威脅著人們的健康和生命安全[2]。探究PLC的發病機制，尋找準確度較高的生物標志物以評估PLC的預后具有重要意義。miRNA是一類由18～24個核苷酸組成的不具備編碼蛋白質功能的單鏈RNA，可參與PLC的發病及進展過程[3-5]。研究表明，miR-557參與了胰腺癌[6]、乳腺癌[7]、肺癌[8]等的發生和發展，但目前有關miR-557與PLC關系的報道較少。有研究發現，miR-557可通過靶向抑制促紅細胞生成素肝細胞激酶受體膜結合配體B2(EphrinB2)，抑制胰腺導管腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[9]。另有研究表明，EphrinB2與PLC的發生、發展密切相關[10-11]。由此推測，miR-557可能通過靶向EphrinB2參與了PLC的發病及進展。本文通過檢測miR-557在PLC組織中的表達水平，探究其與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2015年4月至2017年6月在秭歸縣人民醫院就診的114例PLC患者作為研究對象。參照《原發性肝癌規范化病理診斷指南(2015年版)》[12]診斷PLC。納入標準：(1)經病理檢查確診為PLC；(2)年齡>18歲；(3)具有保存完好的PLC組織及癌旁組織(距離腫瘤邊緣>2 cm)標本；(4)能夠配合完成相關檢查；(5)簽署了知情同意書。排除標準：(1)就診前曾接受放射治療、化學治療；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)Child-Pugh分級C級；(4)隨訪失聯；(5)腎病綜合征或腎移植患者。114例PLC患者中男性76例，女性38例，年齡48～70歲，平均年齡為(61.78±4.61)歲。本研究經醫院醫學倫理委員會批準(批件號：201502003)。

1.2 信息收集

收集所有入組受試者的年齡、性別、Child-Pugh分級、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)、腫瘤直徑、腫瘤數量、腫瘤分期及治療方案等信息。于患者出院后1個月開始隨訪，采用電話隨訪或復診方式了解PLC患者的預后生存情況，每3個月隨訪1次，為期3年，末次隨訪時間為2020年6月6日。

1.3 miR-557表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測組織中miR-557的表達水平。具體步驟：無菌環境下剪碎組織、研磨，取研磨液，4 000 r/min離心15 min，離心后提取上層清液；采用TRIzol法提取總RNA，運用紫外分光光度計檢測其純度；使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA；使用PCR儀進行擴增反應，反應條件為94 ℃預變性5 min，之后94 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，共計35個循環。以GAPDH為內參，ΔCt=CtmiR-557-CtGAPDH，采用2-ΔΔCt計算miR-557的相對表達量。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司設計，序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 PLC患者組織中miR-557的表達水平

miR-557在PLC組織中的相對表達量為0.81±0.14，低于癌旁組織(1.16±0.11)，兩組的差異有統計學意義(t=19.756，P<0.001)。

2.2 PLC組織中miR-557的表達與患者臨床病理特征的關系

如表2所示，miR-557在不同年齡、性別、Child-Pugh分級、HBsAg、AFP水平及腫瘤數量的患者PLC組織中表達水平的差異均無統計學意義(P均>0.05)。miR-557在腫瘤直徑>5 cm、腫瘤分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者PLC組織中的表達水平分別低于腫瘤直徑≤5 cm、腫瘤分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統計學意義(P均<0.05)。

表2 PLC組織中miR-557的表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 患者生存情況

114例PLC患者在隨訪3年后有38例死亡，患者的3年生存率為66.67%(76/114)。根據患者預后生存情況將患者分為生存組(n=76)和死亡組(n=38)。生存組PLC組織中miR-557的相對表達量為0.87±0.12，高于死亡組(0.71±0.11)，差異有統計學意義(t=6.507，P<0.001)。miR-557預測PLC患者預后生存的ROC曲線下面積(AUC)、最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.824(95%CI：0.741～0.889)、0.79、76.32%和73.68%，見圖1。以miR-557評估PLC患者預后生存的最佳截斷值為分界點，將PLC患者分為miR-557高表達組(n=68)和miR-557低表達組(n=46)。miR-557高表達組的中位生存時間為36個月，長于miR-557低表達組(23個月)，差異有統計學意義(log-rankχ2=25.688，P<0.001)，見圖2。

圖1 PLC組織中miR-557預測PLC患者預后生存的ROC曲線

圖2 miR-557高表達組和低表達組的生存情況

2.4 影響PLC患者預后生存的相關因素

將可能與PLC患者預后有關的因素如年齡、性別、Child-Pugh分級、HBsAg、AFP、腫瘤數量、腫瘤直徑、腫瘤分期、治療方案及miR-557作為自變量，將PLC患者的預后生存情況作為因變量，納入Cox單因素回歸分析，結果顯示Child-Pugh分級、腫瘤直徑、腫瘤分期及miR-557與PLC患者預后生存有關(P<0.05)。將Child-Pugh分級、腫瘤直徑、腫瘤分期及miR-557作為自變量，將PLC患者的預后生存情況作為因變量，納入Cox多因素回歸分析，結果顯示腫瘤直徑和腫瘤分期是PLC患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，miR-557是PLC患者預后的獨立保護因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響PLC患者預后的單因素和多因素Cox比例風險回歸分析

3 討論

大多數PLC患者在確診時已屬于晚期，失去了最佳治療時機，預后較差。因此，盡早確診并積極治療是改善PLC患者預后的關鍵[13]。鑒于此，探究PLC的發病機制，尋找預后評估效能較高的生物標志物具有重要意義。本研究結果表明，PLC組織中miR-557的表達水平低于癌旁組織，提示miR-557可能參與了PLC的發病。本研究進一步分析了PLC組織中miR-557的表達與患者臨床病理特征的關系，結果顯示miR-557在腫瘤直徑>5 cm、腫瘤分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者PLC組織中的表達水平分別低于腫瘤直徑≤5 cm、腫瘤分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者。這提示miR-557的表達與PLC患者的腫瘤直徑及腫瘤分期有關，其病理、生理機制有待進一步研究證實。

本研究結果顯示，PLC患者的3年生存率為66.67%，與王鋼等[14]的研究結果相近。本研究比較了生存組與死亡組PLC組織中miR-557的表達水平，結果顯示生存組miR-557的表達水平高于死亡組，這提示miR-557可能與PLC患者的預后有關，其表達水平或可反映預后生存情況。方旭東等[15]研究顯示，中性粒細胞/淋巴細胞比值、血小板/淋巴細胞比值預測PLC患者預后的AUC分別為0.625和0.678，表明其預測效能較低。本研究結果顯示，miR-557預測PLC患者預后的AUC、敏感度和特異度分別為0.824、76.32%和73.68%，這提示miR-557預測PLC患者預后的效能較高，但敏感度和特異度偏低，其可作為輔助評估手段。

為進一步闡明miR-557與PLC患者預后的關系，本文比較了miR-557高表達組與低表達組的生存情況，結果顯示miR-557高表達組的中位生存時間長于miR-557低表達組，這提示miR-557與PLC患者預后生存時間有關。既往研究表明，腫瘤直徑、腫瘤分期與PLC患者預后密切相關[16-19]。為避免混雜因素影響分析結果，本文采用Cox比例風險回歸模型分析影響PLC患者預后的相關因素，結果顯示腫瘤直徑和腫瘤分期是PLC患者預后的獨立危險因素，與上述研究結果一致。此外，本研究結果還指出miR-557是PLC患者預后的獨立保護因素，推測其原因可能是miR-557高表達可抑制EphrinB2表達，進而抑制PLC細胞增殖、遷移和侵襲，從而反映PLC患者的預后情況。

本研究尚存在一定不足，如為單中心研究、納入研究的樣本量偏小等，此外，在樣本的選擇上也存在一定偏倚，下一步將開展大樣本、多中心研究。綜上所述，miR-557在PLC組織中低表達，且與腫瘤直徑和腫瘤分期有關。檢測PLC組織中miR-557的表達水平有助于評估患者的預后生存情況，其表達水平越低，提示患者的預后生存率越低、生存時間越短。