A20在膽管結扎所致肝纖維化小鼠中的表達及作用機制研究

王曉晗 韓 豐 沈 亮 陳云清 沈月玉 高 晨 侯震濤 冀子中 范竹萍

肝纖維化是影響肝臟疾病轉歸和肝細胞癌(HCC)風險的關鍵因素，與肝臟疾病的進展相關[1]。盡管肝纖維化的病因不同，但其進展遵循的模式是類似的。肝星狀細胞(HSC)在肝損傷后被激活，產生大量細胞外基質和促炎介質，在纖維生成中發揮著關鍵作用[2]。

目前已知A20是一種有效的抗炎蛋白。本課題組的既往研究發現，A20參與了肝纖維化的過程，但具體作用機制尚不清楚[3]。本研究主要探討A20及炎性因子在膽管結扎(BDL)所致肝纖維化模型小鼠肝臟中的表達情況，并在細胞水平探討A20的作用機制。

1 材料與方法

1.1 BDL所致肝纖維化小鼠模型的構建

采用6～8周齡的C57/B6雄性小鼠，BDL組小鼠(5只)用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開腹，結扎膽管后關腹。對照組小鼠(5只)不結扎膽管，直接關腹。10 d后處死小鼠，留取肝臟備用。取肝臟組織，浸于4%多聚甲醛中固定，脫水透明，石蠟包埋，0.5 μm切片，脫蠟后行H-E染色，顯微鏡觀察并作圖像采集。

1.2 細胞培養

LX-2細胞是永生化的人HSC(購自ATCC)，置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。使用0.1 μg/mL 脂多糖(LPS)處理LX-2細胞0、5、10、15、30、60 min，收獲后冷凍保存備用，檢測細胞中A20及炎性反應通路因子的蛋白表達水平變化。

1.3 蛋白質印跡法檢測

使用蛋白裂解緩沖液從細胞中提取總蛋白，檢測蛋白水平。將不同樣品中等量的蛋白質經SDS-PAGE電泳后電轉至硝酸纖維素濾膜中。在室溫下用5%脫脂牛奶阻斷非特異性蛋白結合120 min，將特異性單克隆抗體涂于膜上，4 ℃孵育過夜。用TBST沖洗后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶15 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌后顯影成像，以GAPDH作為內參標準。

1.4 肝臟RNA提取

取小塊肝組織置入1 mL TRIzol試劑中充分研磨。裂解后樣品于室溫下放置，加入氯仿后劇烈振蕩，室溫孵育后離心。取上層水相加入異丙醇，混勻后室溫孵育、離心。乙醇清洗RNA后溶解于DEPC水中，RNA溶液置于-80 ℃保存備用。

1.5 實時熒光PCR法檢測

使用PrimerScriptTMRT試劑盒(日本TaKaRa公司)，按照說明書進行cDNA合成，反應條件：37 ℃ 15 min，84 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min。應用兩步法PCR擴增程序，總反應體系10 μL，第1步95 ℃ 30 s；第2步95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。所有RT-PCR重復3次。RT-PCR引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。轉化生長因子-β(TGF-β)、IL-6、IL-1β、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、Toll樣受體4(TLR4)的mRNA相對表達量以2-△△Ct計算，以β-actin作為內參。

表1 引物序列

1.6 統計學處理

使用Graphpad Prism 5軟件進行統計學分析，計量數據以均數±標準差表示，各組均數比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝纖維化模型小鼠的肝臟病理驗證

本研究應用BDL術(術后10天)構建肝纖維化小鼠模型，小鼠肝臟經H-E染色，高倍鏡下顯示，對照組小鼠肝細胞呈多邊形，大小正常，核圓、居中，細胞質豐富，小葉結構清晰，未見纖維組織增生；BDL組小鼠肝細胞片狀壞死，大膽管增生，肝纖維化明顯。見圖1。

圖1 兩組小鼠肝臟病理圖 H-E染色 ×400 A 對照組 B BDL組

2.2 兩組小鼠肝臟中α-平滑肌肌動蛋白和A20蛋白的表達水平比較

應用蛋白質印跡法(Western blotting)檢測兩組小鼠的肝臟組織中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、A20蛋白的表達水平，結果顯示BDL組小鼠的α-SMA蛋白表達水平(2.12±0.87)為對照組(1.01±0.16)的2.11倍，差異有統計學意義(P<0.05)；BDL組小鼠的A20蛋白表達水平(1.63±0.38)為對照組(0.66±0.47)的2.47倍，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 兩組小鼠肝臟中α-SMA及A20蛋白的表達水平比較 A α-SMA蛋白 B A20蛋白

2.3 兩組小鼠肝臟中炎性因子的mRNA相對表達量比較

應用實時熒光PCR法(Real-time PCR)檢測兩組小鼠肝臟中炎性因子的mRNA相對表達量，結果顯示BDL組小鼠肝臟內TGF-β、IL-6、IL-1β、MCP-1、TLR4的mRNA相對表達量(2.12±0.63，32.39±10.81，1.71±0.32，43.76±2.58，3.76±1.99)分別為對照組(1.09±0.22，5.89±4.64，0.69±0.31，1.16±0.22，0.84±0.48)的1.94倍、5.50倍、2.47倍、37.59倍、4.50倍，差異均有統計學意義(P=0.032 8、P=0.001 0、P=0.004 6、P<0.000 1、P=0.014 6)。見圖3。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 兩組小鼠肝臟中炎性因子的mRNA相對表達量比較 A TGF-β mRNA B IL-6 mRNA C IL-1β mRNA D MCP-1 mRNA E TLR4 mRNA

2.4 LX-2細胞中A20及炎性反應通路因子的蛋白表達水平變化

使用0.1 μg/L的LPS處理LX-2細胞0、5、10、15、30、60 min，通過Western blotting檢測發現IκBα、磷酸化IκBα蛋白的表達水平在處理15 min時到達高峰，隨后開始下降；A20蛋白表達水平先下降，隨后在處理30 min時逐漸上升。見圖4。

圖4 LX-2細胞中A20及炎性反應通路因子的蛋白表達水平變化

3 討論

目前利用BDL術造成肝外膽道梗阻，引起梗阻部位以上的膽管擴張是構建小鼠肝纖維化模型的有效方法[4]。在膽管阻塞早期，門脈系統發生炎性細胞浸潤，膽管增生和小膽管內膽汁淤積；如梗阻持續，纖維組織向膽管延伸，包繞肝小葉，則形成肝纖維化。本研究中，BDL組小鼠的病理圖像顯示肝細胞片狀壞死，大膽管增生，肝纖維化明顯。

A20是一種有效的抗炎分子，與人類和小鼠的多種炎性反應病理有關[5]。既往的動物模型實驗結果顯示，肝臟中過表達A20是急性暴發性病毒性肝炎、高危性肝切除術和嚴重的肝臟缺血再灌注損傷的保護因素[6]。Ramsey等[7]的研究建立了小鼠缺血再灌注損傷模型，在小鼠尾靜脈注入高表達A20 的腺病毒，發現A20過表達組的存活率為67%，而對照組僅為10%～25%，并且A20過表達組的總膽紅素(TBil)、ALT水平下降，肝臟出血壞死、脂肪變性減輕，肝功能改善。Man 等[8]分別利用正常大鼠和肝硬化大鼠制備肝臟缺血模型，發現A20表達上調后，兩組的肝臟缺血再灌注損傷均得到改善。另有研究在蛋白質組學方面探討原代肝細胞對缺血再灌注的反應，發現損傷后的肝細胞內A20表達明顯升高[9]。有研究用LPS 刺激急性肝炎模型小鼠，結果顯示A20轉染組小鼠的存活率達85%，而對照組僅為15%～20%，提示A20對肝細胞有保護作用[10]。Longo等[11]的研究發現小鼠肝臟被切除78%后24 h，對照組小鼠肝細胞內A20 mRNA 水平較切除前高13 倍，而A20轉染過表達組小鼠肝細胞內A20 mRNA水平較切除前高50～60 倍；術后36 h A20轉染過表達組小鼠肝細胞內的肝細胞脂肪變、肝竇充血較對照組小鼠明顯減輕，出血發生率明顯下降。SD大鼠、LEW大鼠肝臟移植研究發現，肝臟內A20高表達有利于提高大鼠存活率，并且存活率與A20表達水平呈正相關，A20表達下調可導致小體積肝移植損傷，而高表達A20能增強小體積肝移植后的肝再生能力并提高存活率，可抵抗排異反應[12-14]。本研究發現肝纖維化模型小鼠肝臟中A20和α-SMA蛋白表達水平均升高，炎性因子TGF-β、IL-6、IL-1β、MCP-1、TLR4的mRNA相對表達量也均升高，提示A20可能參與了肝纖維化進程中的炎性反應。

NF-κB是一個關鍵的轉錄因子，通過誘導炎性反應基因的表達，可調節炎性反應級聯反應的多個步驟。研究表明，抑制NF-κB/IκBα信號通路可改善肝纖維化的嚴重程度[15]。NF-κB調節炎性反應信號引起肝臟內促炎因子的表達，如TGF-β、TNF-α、IL-1β和IL-6等，這些促炎因子在肝纖維化的發展中發揮著重要的作用，抑制NF-κB /IκBα通路可能是肝纖維化的一個治療方法[16]。本研究發現，經過LPS處理的LX-2細胞中，隨著IκBα及磷酸化IκBα蛋白的表達水平升高，A20蛋白的表達水平降低；當IκBα及磷酸化IκBα蛋白的表達水平達到峰值后下降時，A20蛋白的表達水平開始逐步升高。可見，A20在炎性反應通路中發揮著負向調節作用，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，A20可能參與了BDL所致肝纖維化模型小鼠的炎性反應；在人HSC中，A20在炎性反應通路中發揮著負向調節作用。今后本課題組將通過過表達或沉默A20，進一步研究其在原代HSC炎性反應通路中的作用機制。