NRG4在克羅恩病組織中的表達及意義

朱良潤 宋麗亞 張 楠

克羅恩病(CD)在歐美國家中發病率較高，近年來在中國CD的發病率呈升高趨勢[1]。CD是一種病因尚未完全闡明的慢性消化道炎性疾病，主要的臨床表現包括發熱、腹痛、腹部包塊及肛周病變等[2-3]。CD患者的臨床表現差異較大，常見表現為緩解和復發交替，部分患者可發生消化道大出血、腸梗阻、腸瘺或腸穿孔等并發癥，甚至需接受腸切除手術治療[4]。因此，盡早了解CD活動度及患者預后情況，密切觀察并積極治療，對于改善患者的預后具有重要意義。

神經調節蛋白4(NRG4)是一種含有表皮生長因子類似區域的蛋白，可與表皮生長因子受體ErbB4特異性結合，具有刺激細胞增殖、抑制細胞凋亡等生理學功能[5-6]。研究顯示，NRG4可通過調控Src通路抑制壞死性小腸結腸炎腸上皮細胞凋亡，并促進腸道功能恢復[7]。此外，NRG4與ErbB4特異性結合后可通過調控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號轉導通路，拮抗由TNF-α和干擾素-γ(IFN-γ)誘導的結腸上皮細胞凋亡[8]。基于上述研究，推測NRG4參與了CD的發病及進展過程，檢測其水平有助于了解CD活動度及患者預后情況。本文探究了NRG4在CD組織中的表達水平及臨床意義，以期為評估CD的病情及預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年4月至2019年10月在青島市第三人民醫院就診的97例CD患者作為研究對象，設為CD組；另選擇同期行結直腸鏡檢查并切除息肉的63例患者作為對照組。根據《中國炎癥性腸病組織病理診斷共識意見》[9]診斷CD并進行治療。納入標準：(1)確診為CD；(2)接受結直腸鏡檢查；(3)年齡18～70歲；(4)能配合完成相關檢查；(5)簽署了知情同意書。排除標準：(1)合并除CD外其他自身免疫性疾病；(2)就診前接受過抗炎藥物治療；(3)肝、腎功能不全；(4)合并惡性腫瘤；(5)未定期復診。CD組中男性53例，女性44例，年齡27～62歲，平均年齡為(44.02±7.26)歲；對照組中男性37例，女性26例，年齡30～55歲，平均年齡為(42.67±5.45)歲。兩組患者在年齡(t=1.266，P=0.207)、性別(χ2=0.260，P=0.610)方面比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 鏡下活動度

采用CD簡化內鏡評分(SES-CD)評價CD活動度[10]。將腸道分為末端回腸、右半結腸、橫結腸、左半結腸和直腸，分別從潰瘍大小、潰瘍面積、累及腸段的面積和腸腔狹窄這4個方面進行評價，單項評分為0～3分，評分越高表示病情越嚴重。SES-CD評分≤3分為CD緩解期，SES-CD評分≥4分為CD活動期。CD活動期細分為輕度、中度、重度，其中輕度CD指4分≤SES-CD評分≤10分，中度CD指11分≤SES-CD評分≤19分，重度CD指SES-CD評分≥20分。

1.3 治療方案及近期預后評估

參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年，北京)》[11]對CD患者進行治療。所有患者給予常規治療，包括營養支持，糾正水、電解質平衡紊亂，保護腸道黏膜及調節腸道菌群等。此外，根據患者病情給予糖皮質激素、免疫抑制劑或生物制劑等。

參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年，北京)》[11]評估患者預后情況。臨床緩解指CD患者臨床癥狀消失，經結直腸鏡檢查顯示潰瘍、炎性反應均有好轉或克羅恩病活動指數(CDAI)評分<150分；早期復發指治療3個月內，經藥物治療進入緩解期后，CD相關癥狀再次出現，且相關炎性指標及結直腸鏡檢查結果顯示有疾病活動的證據，或CDAI評分升高幅度>70分。

1.4 CD組織中NRG4的表達水平檢測

采用蛋白質印跡法檢測CD組織中NRG4的表達水平[12]。將RIPA裂解液滴至裝有CD組織的試管中裂解組織細胞，4 ℃ 4 000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min，提取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白質定量。凝膠電泳80 V 15 min，然后加壓至120 V，直至溴酚藍跑出膠面，之后轉膜、PBS洗膜。滴加兔抗人NRG4單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，次日滴加二抗，室溫孵育1 h。使用ELC發光液顯影，應用ImageJ軟件分析實驗結果。本實驗所用抗體均購自上海滬震實業有限公司。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 NRG4在CD組織中的表達

CD組中NRG4的相對表達量為0.74±0.18，低于對照組(1.51±0.25)，兩組的差異有統計學意義(t=22.632，P<0.001)。

2.2 NRG4與CD活動度的關系

在97例患者中，輕度CD患者25例(25.77%)，中度CD患者43例(44.33%)，重度CD患者29例(29.90%)，分別設為輕度組、中度組和重度組。輕度組、中度組和重度組NRG4的相對表達量分別為0.90±0.12、0.76±0.13和0.56±0.15，3組間差異有統計學意義(F=44.120，P<0.001)。其中，輕度組NRG4的表達水平高于中度組和重度組，差異有統計學意義(q=5.710、13.075，P<0.05)；中度組NRG4的表達水平高于重度組，差異有統計學意義(q=8.874，P<0.05)。CD患者NRG4的表達水平與SES-CD評分呈負相關關系(r=-0.598，P<0.001)。NRG4診斷中、重度CD患者的ROC曲線下面積(AUC)為0.844(95%CI：0.756～0.909)，最大約登指數為0.561，其所對應的最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.76、68.06%和88.00%，見圖1。

圖1 NRG4診斷中、重度CD患者的ROC曲線

2.3 NRG4與CD早期復發的關系

97例CD患者經治療后有69例(71.13%)臨床緩解(設為未復發組)，其余28例(28.87%)復發(設為早期復發組)。兩組在年齡、性別、疾病類型、病變位置、C反應蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)及首次治療使用激素方面比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)。與未復發組比較，早期復發組合并肛周病變的比例較高，NRG4的表達水平較低，差異均有統計學意義(P均<0.05)，見表1。NRG4診斷CD早期復發的AUC為0.952(95%CI：0.889～0.985)，最大約登指數為0.785，其所對應的最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.61、85.71%和92.75%，見圖2。以P<0.10為入選標準，將疾病類型、肛周病變和NRG4作為自變量，將早期復發作為因變量納入多因素logistic回歸模型，結果顯示疾病類型為穿透型[OR=3.702(95%CI：1.845～5.891)，P=0.010]、合并肛周病變[OR=1.948(95%CI：1.224～4.007)，P=0.005]是CD早期復發的獨立危險因素(P<0.05)，NRG4[OR=0.208(95%CI：0.105～0.591)，P<0.001]是CD早期復發的獨立保護因素(P<0.05)。

圖2 NRG4診斷CD早期復發的ROC曲線

表1 兩組的基本資料比較

3 討論

不同地區、人種的CD發病率和臨床特征存在一定差異[13]。CD的發病原因尚未完全明確，目前多認為與遺傳、環境等因素有關[14]。盡早明確CD的病因對于臨床診治具有重要意義。研究顯示，CRP和ESR判斷CD活動度具有一定價值，但兩者的敏感度較低，且ESR的特異度也較低[15]。因此，仍需探究敏感度和特異度均較高的生物標志物以準確判斷CD活動度。

NRG4基因位于人類染色體15q24，其蛋白主要表達于棕色脂肪組織[16]。已有研究表明，NRG4具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、抑制肝細胞脂代謝等作用[17-19]。研究顯示，NRG4與上皮細胞相關疾病關系密切，如NRG4可通過調控Src通路抑制壞死性小腸結腸炎腸上皮細胞凋亡[7]，并可通過調控PI3K/Akt信號轉導通路拮抗由TNF-α和IFN-γ誘導的結腸上皮細胞凋亡[8]。由此推測，NRG4在CD組織中特異性表達，參與了CD的發病及進展，檢測其水平可了解腸上皮黏膜細胞的凋亡情況。

本研究采用蛋白質印跡法檢測CD組織和腸息肉組織中NRG4的表達水平，結果顯示CD組織中NRG4的表達水平低于腸息肉組織，提示NRG4的表達水平可能與CD的發病及進展有關。本研究比較了輕度、中度、重度CD患者的NRG4表達水平，結果顯示隨CD活動度加重，CD組織中NRG4的表達水平呈下降趨勢，且NRG4的表達水平與SES-CD評分呈負相關關系，進一步證實NRG4參與了CD的發病及進展過程。本研究構建了NRG4診斷中、重度CD活動度的ROC曲線，結果顯示其診斷的AUC、敏感度和特異度分別為0.844、68.06%和88.00%，這提示NRG4對CD活動度的判斷具有較高價值，但敏感度較低。

CD反復發作可誘發消化道大出血、腸瘺、腸梗阻、腸穿孔等嚴重并發癥，必要時需采取腸切除手術治療[20]。即使接受了腸切除手術治療，仍有部分CD患者術后復發，且術后復發率較高[21]。CD臨床緩解與復發交替不僅會誘發嚴重并發癥，還會增高癌變風險[22]，若能及時了解復發情況，密切觀察并采取有效的干預措施，可大幅降低CD預后不良風險。本研究構建了NRG4診斷CD早期復發的ROC曲線，結果顯示其診斷CD早期復發的AUC、敏感度和特異度分別為0.952、85.71%和92.75%，這提示CD組織中NRG4的表達水平對于評估CD患者的近期預后具有較高價值，有助于及時采取有效的干預措施以避免CD復發。為進一步明確NRG4與CD早期復發的關系，本文采用多因素logistic回歸方法分析了影響CD患者治療后早期復發的相關因素，結果顯示疾病類型為穿透型、合并肛周病變是CD早期復發的獨立危險因素，NRG4是CD早期復發的獨立保護因素。

綜上所述，NRG4在CD組織中呈低表達。CD組織中NRG4的表達水平越低，提示患者病情越嚴重，CD早期復發的風險也越高。檢測CD組織中NRG4的表達水平有助于了解患者的CD活動度和近期預后情況，便于及時采取針對性治療，從而改善預后。本研究的不足之處在于隨訪時間較短，下一步研究將延長隨訪時間，以明確NRG4的表達水平對于CD患者遠期預后的診斷價值。