miR-23a/SATB2信號通路對結直腸癌SW480細胞凋亡和轉移的影響

高永濤 白 浪 樊 華 劉 濤 姬 樂 雷 星 鄧世波 袁江濤

結直腸癌(CRC)的進展和轉移與腫瘤細胞的惡性生長、轉移及凋亡減少有關，并且這些腫瘤細胞的生物學特性與基因調控有關，通過研究基因調控腫瘤細胞功能探討腫瘤發生機制，對于分子靶向治療腫瘤具有重要意義[1]。miRNA在疾病發生中發揮著重要作用，目前已知miRNA在心血管系統疾病、缺氧損傷中扮演著關鍵角色，miRNA還可作為疾病治療的靶點[2]。miR-23a參與了細胞發育過程中的不同階段，如細胞增殖、變異、凋亡等，對于骨骼肌和神經的發育起著重要作用[3-4]。近年來的研究表明，miR-23a與人類腫瘤關系密切，在許多腫瘤(膠質瘤、口腔鱗癌、胰腺癌)中發揮著促癌作用，靶向下調miR-23a的表達可抑制腫瘤的進展和轉移[5-7]。既往研究顯示，miR-23a在CRC組織中表達上調，并且具有促進CRC細胞增殖的作用[8]。目前對于miR-23a在CRC細胞凋亡及轉移中的作用和調控機制尚不清楚，本研究以CRC SW480細胞作為實驗對象，探討在體外下調miR-23a表達對CRC細胞惡性表型的作用，為尋找有效的CRC分子治療靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

CRC SW480細胞購自微蒙生物科技(上海)有限公司；兔多抗[剪切的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(C-Caspase-3)抗體]、特殊富含AT序列結合蛋白2(SATB2)抗體購自美國Abcam公司；miR-23a抑制劑(inhibitor)、inhibitor對照(control)由吉滿生物科技(上海)有限公司合成；Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體購自美國Santa Cruz公司；熒光素酶報告載體由江蘇凱基生物技術股份有限公司合成；miR-23a模擬物(mimics)和mimics control由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；CCK-8增殖檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司；SATB2小干擾RNA(siRNA)、siRNA control由上海美軒生物科技有限公司合成。

1.2 細胞轉染

當SW480細胞匯合度約為40%時，采用Lipofectamine 2000試劑進行細胞轉染，操作步驟按照轉染試劑說明書進行。將轉染miR-23a inhibitor、inhibitor control后的 SW480細胞記為Anti-miR-23a、Anti-NC，將沒有轉染的細胞記為對照(Control)。

1.3 定量RT-PCR法檢測miR-23a表達

取培養48 h后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細胞，添加TRIzol試劑，提取細胞中的總RNA。使用反轉錄試劑盒合成cDNA，cDNA保存在-20 ℃冰箱。定量RT-PCR(qRT-PCR)反應體系如下：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix、1 μL上游引物、1 μL下游引物、2.5 μL cDNA，添加RNAse free水至25 μL。qRT-PCR反應程序為：95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40個循環。內參為U6，按照2-△△Ct法計算miR-23a mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖

將轉染后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細胞接種到96孔板中，每個孔內加100 μL細胞懸浮液，置于37 ℃培養箱中培養48 h后，取出培養板，添加10 μL CCK-8溶液，置于避光條件下孵育4 h。在酶標儀上測定OD值，波長為450 nm。

1.5 平板克隆法檢測細胞克隆能力

將轉染后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細胞接種到6孔板中，每個孔內添加1 000個細胞，添加2 mL的細胞培養液，培養13 d后，在顯微鏡下可觀察到細胞團形成。用PBS洗滌細胞團，添加0.1%結晶紫工作液將細胞染色，在顯微鏡下觀察超過50個細胞的克隆形成數目。

1.6 流式細胞術測定細胞凋亡

取培養48 h后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細胞，用PBS洗滌后，每組收集約1×106個細胞，用PBS溶液懸浮洗滌后，添加250 μL結合緩沖液重懸細胞，過400目網篩，添加5 μL Annexin V-FITC溶液染色后，混合均勻，在避光條件下孵育20 min。添加PI染色液10 μL，混合均勻，在避光條件下孵育5 min。置于流式細胞儀上檢測細胞凋亡的變化。

1.7 Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移

按1∶10稀釋基質膠，吸取60 μL添加至Transwell小室的上室中，2 h后觀察基質膠已變成凝膠狀。取Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細胞，用不含血清的培養液將細胞懸浮并添加300 μL到小室的上室中，細胞密度為5×105/L。在下室中添加500 μL含有血清的細胞培養液，置于37 ℃中孵育培養48 h。取出小室，用甲醇固定，結晶紫染色以后，在顯微鏡下觀察穿膜細胞數量即為細胞侵襲數量。細胞遷移步驟同上，省去基質膠濕化步驟。

1.8 蛋白質印跡法檢測MMP-2、C-Caspase-3蛋白的表達水平

取培養48 h以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細胞，分別添加細胞裂解溶液，混合均勻，置于冰上反應30 min，以12 000 r/min離心10 min，吸取蛋白溶液，加入到Loading Buffer中混合，煮沸反應5 min。配置10%分離膠和6%濃縮膠，每個孔內添加40 μg蛋白，打開電源，將電壓調整為80 V，當樣品馬上進入分離膠時，將電壓調整為100 V，電泳約1.5 h后，進行轉膜。轉膜在冰上進行，200 mA電流，將蛋白從凝膠上轉移到NC膜。NC膜置于5%牛血清白蛋白中，室溫孵育90 min，然后置于一抗孵育液中，室溫孵育2 h，最后置于二抗孵育液中，室溫孵育1.5 h。二抗按1∶4 000稀釋，MMP-2、C-Caspase-3抗體分別按1∶1 000和1∶600稀釋。滴加ECL發光試劑，以GAPDH為參照，分析蛋白表達變化。

1.9 miR-23a靶基因預測和鑒定

利用生物信息學軟件targetscan在線預測miR-23a的靶基因，發現SATB2的3′端非編碼區(3′UTR)與miR-23a有互補結合位點，構建含有SATB2的3′UTR的野生型熒光素酶報告載體(WT)和突變型熒光素酶報告載體(MUT)，將WT和MUT分別與miR-23a mimics和mimics control共轉染至SW480細胞中，48 h后用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性變化。

1.10 SATB2 siRNA對下調miR-23a表達影響SW480細胞增殖、克隆、凋亡、侵襲和遷移的逆轉作用

在SW480細胞中分別共轉染miR-23a inhibitor、siRNA control和miR-23a inhibitor、SATB2 siRNA，記為Anti-miR-23a+si-NC、Anti-miR-23a+si-SATB2。采用上述CCK-8、平板克隆實驗、流式細胞術、Transwell小室、Western blot方法檢測細胞增殖、克隆、凋亡、侵襲和遷移，以及SATB2、MMP-2、C-Caspase-3蛋白表達水平。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 miR-23a inhibitor轉染對SW480細胞中miR-23a mRNA表達的影響

如表1所示，與Anti-NC組相比，SW480細胞中轉染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a組細胞中的miR-23a mRNA相對表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明miR-23a inhibitor可抑制SW480細胞中miR-23a mRNA的表達。

表1 各組細胞中miR-23a mRNA相對表達量的比較()

2.2 miR-23a inhibitor轉染對SW480細胞增殖、克隆、凋亡的影響

與Anti-NC組相比，SW480細胞中轉染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a組細胞的OD值降低，克隆形成數量減少，細胞凋亡率升高，細胞中C-Caspase-3蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P均<0.05)，見圖1、表2。結果表明miR-23a inhibitor可抑制SW480細胞的增殖、克隆，并可誘導凋亡。

圖1 各組SW480細胞的凋亡和C-Caspase-3蛋白表達水平比較 A 流式細胞術檢測各組SW480細胞的凋亡 B 蛋白質印跡法檢測各組SW480細胞中C-Caspase-3蛋白的表達水平

表2 各組SW480細胞的OD值、克隆形成數量、凋亡率及C-Caspase-3蛋白表達水平比較()

2.3 miR-23a inhibitor轉染對SW480細胞侵襲和遷移的影響

與Anti-NC組相比，SW480細胞中轉染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a組細胞的侵襲和遷移數量減少，細胞中MMP-2蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)，見圖2、表3。結果表明miR-23a inhibitor可抑制SW480細胞的侵襲和遷移。

圖2 蛋白質印跡法檢測各組SW480細胞中MMP-2蛋白表達水平

表3 各組SW480細胞的遷移、侵襲數量及MMP-2蛋白表達水平比較()

2.4 miR-23a對SATB2表達的調控

靶基因預測軟件發現，miR-23a與SATB2的3′UTR有互補結合位點，與mimics control組相比，miR-23a mimics共轉染后的WT SW480細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。與Anti-NC組相比，SW480細胞中轉染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a組細胞的SATB2蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明miR-23a可靶向負調控SATB2的表達。見圖3、表4、表5。

表4 兩組熒光素酶活性比較()

表5 兩組SW480細胞中SATB2蛋白的表達水平比較()

圖3 miR-23a靶基因預測 A miR-23a與SATB2的3′UTR互補結合位點 B 蛋白質印跡法檢測兩組SW480細胞中SATB2蛋白的表達水平

2.5 SATB2 siRNA對下調miR-23a影響SW480細胞增殖、克隆、凋亡和侵襲遷移的逆轉作用

與Anti-miR-23a+si-NC組相比，SW480細胞中共轉染SATB2 siRNA和miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a+si-SATB2組細胞的增殖、克隆、侵襲、遷移能力均增強，MMP-2蛋白表達水平升高，細胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白表達水平均降低，SATB2蛋白表達水平下降，差異均有統計學意義(P均<0.05)，見圖4、表6。結果表明SATB2 siRNA可逆轉下調miR-23a表達對SW480細胞增殖、克隆、侵襲、遷移的抑制作用及誘導凋亡作用。

圖4 兩組SW480細胞的凋亡和C-Caspase-3、MMP-2、SATB2蛋白表達水平比較 A 流式細胞術檢測兩組SW480細胞的凋亡 B 蛋白質印跡法檢測兩組SW480細胞中C-Caspase-3、MMP-2、SATB2蛋白的表達水平

表6 兩組SW480細胞的OD值、凋亡率、克隆形成、遷移、侵襲數量及C-Caspase-3、MMP-2、SATB2蛋白表達水平比較()

3 討論

miRNA在人類腫瘤中具有十分重要的意義，一些miRNA分子在腫瘤中表達異常，可能是腫瘤診斷的標志物，還有一些miRNA的表達異常與腫瘤的發生及轉移有關[9]。miR-23a是近年來發現的與腫瘤有關的調控分子，對于腫瘤的進展具有重要意義[10]。既往研究發現，miR-23a參與了細胞的生長和分化，對于組織炎性反應、細胞代謝具有調節作用[11]。miR-23a在神經系統腫瘤中高表達，并可正向調控腫瘤細胞的侵襲和遷移[12]。在B細胞淋巴瘤、乳腺癌等組織中也發現miR-23a呈高表達[13-14]。CRC相關研究顯示，miR-23a在腫瘤組織和細胞中表達上調，與腫瘤的臨床分期和浸潤有關[8]。本研究結果顯示，下調miR-23a后的CRC細胞的增殖、克隆、侵襲和遷移能力下降，細胞凋亡增多，提示下調miR-23a具有抵抗CRC細胞惡性表型的作用，miR-23a在CRC細胞惡性進展中可能發揮了促進作用。

細胞外基質降解是腫瘤細胞向遠處組織轉移和浸潤的基礎，而MMP是細胞外基質降解的關鍵酶，其有多個家族成員，分別可以降解細胞外基質中的不同組分[15]。MMP-2與腫瘤轉移密切相關，是腫瘤細胞轉移能力的標志物[16]。Caspase是在人體組織中存在的蛋白家族，參與了幾乎所有細胞的凋亡過程，也是迄今為止發現的與細胞凋亡關系較為密切的蛋白家族[17]。Caspase-3是Caspase家族的凋亡執行因子，其活化后可促進細胞凋亡的發生，正常狀態下以無活性的酶原形式存在[18]。本研究結果顯示，下調miR-23a后，CRC細胞中的C-Caspase-3蛋白表達水平升高，MMP-2蛋白表達水平降低，這說明下調miR-23a能夠抑制CRC細胞的侵襲并誘導細胞凋亡發生。

miRNA是一類非編碼的RNA，能通過與靶mRNA的3′UTR互補結合，從而影響靶基因的翻譯，并且同一個miRNA分子可有多個靶基因，參與不同的組織生理、病理過程[19]。本研究發現，miR-23a可靶向負調控SATB2的表達，miR-23a的作用機制可能與SATB2有關。既往研究顯示，SATB2是一個在CRC組織和細胞中表達下調的抑癌基因，其可抑制腫瘤細胞的生長和轉移[20-21]。本研究表明，下調SATB2表達可逆轉下調miR-23a表達對CRC細胞增殖、克隆、侵襲和遷移的抑制及對凋亡的促進，說明下調miR-23a調控CRC細胞惡性表型與靶向SATB2有關。

總之，miR-23a在CRC進展中可能發揮了促癌基因的作用，下調其表達可通過靶向上調SATB2抑制CRC細胞增殖、克隆、侵襲和遷移，誘導細胞凋亡發生，這為研究miR-23a在CRC中的作用機制提供了參考，為分子靶向治療CRC提供了新思路。本研究僅在SW480細胞中進行了初步探討，今后的研究將在多種CRC細胞株和體內進行驗證。