組蛋白去甲基化酶KDM5C在炎癥性腸病中的作用研究

陳 萍 朱 華 余亞莉 毛宇娟 卓明星 陳 敏 葉 梅

炎癥性腸病(IBD)是一種非特異性的腸道慢性炎性疾病，包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)，其發病機制目前尚未完全明確。多項研究顯示，表觀遺傳通過調控基因表達、影響炎性反應表型而參與IBD的發生、發展。UC患者結腸組織中總基因組DNA甲基化水平明顯低于正常人，且其在疾病活動期的水平也明顯低于非活動期[1]。Tsaprouni等[2]在2，4，6-TNBS誘導的慢性結腸炎小鼠和CD患者腸黏膜中均發現組蛋白H4(賴氨酸殘基8、12位點)高乙酰化。用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的急性結腸炎模型研究發現，結腸炎組織中一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6和TNF-α等炎性因子呈高表達，其基因啟動子區域H3K27ac的富集水平也顯著升高[3]。

KDM5C是由X染色體編碼轉錄的去甲基化酶，可以催化組蛋白H3K4me2/3脫甲基，使H3K4me2/3的激活轉錄作用減弱，在維持DNA準確復制、神經系統發育和腫瘤細胞增殖等方面起著重要作用[4]。近年來研究顯示，KDM5C在結腸癌、前列腺癌和肝細胞癌中呈高表達[5-6]，在結腸癌細胞中沉默KDM5C可降低其對奧沙利鉑的耐藥性[7]。而在膽管細胞癌中，KDM5C可通過參與脂肪酸代謝抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移[8]。目前尚未見KDM5C在自身免疫性疾病及炎性疾病中的相關研究報道。本研究用葡聚糖硫酸納(DSS)誘導小鼠慢性結腸炎模型，檢測KDM5C的表達變化，并利用KDM5C基因敲除(KDM5C-/-)小鼠建立急性結腸炎模型，探討KDM5C在小鼠結腸炎進程中的作用及機制，為進一步研究KDM5C在結腸炎發病機制中的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2019年11月至2020年9月期間在武漢大學中南醫院接受手術治療的8例潰瘍性結腸炎(UC)患者、10例克羅恩病(CD)患者的結腸黏膜組織標本，另選擇7例結腸息肉患者的結腸黏膜組織標本作為正常對照。取材后將標本迅速保存于-80 ℃冰箱以備實時熒光定量PCR(real-time qPCR)等檢測使用。所有患者均知情同意，本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 實驗動物

本研究采用26只無特定病原體(SPF)級C57BL/6野生型(WT)雄性小鼠，6～8周齡，體質量為18～22 g，由本院動物實驗中心提供。KDM5C-/-小鼠雄性純合子3只(C57BL/6小鼠)，6～8周齡，體質量為16～19 g，由武漢大學基礎醫學院李楓教授惠贈。小鼠飼養在SPF環境中，恒溫(21 ℃～22 ℃)，12 h明暗循環，自由飲水飲食。在實驗開始前，小鼠適應性喂養1周。

1.3 主要材料與試劑

葡聚糖硫酸鈉(DSS)購自美國MP Biomedicals公司。多聚甲醛、H-E染液購自Biosharp公司。EASY spin組織/細胞RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。逆轉錄試劑盒購自日本Toyobo公司。SYBR-Green real-time qPCR試劑盒購于康為世紀生物科技有限公司。引物由武漢擎科生物技術有限公司合成。

1.4 構建小鼠慢性結腸炎模型

將小鼠隨機分為實驗組1(n=10)和對照組1(n=10)。參照chen等[9]的方法構建慢性結腸炎模型。將DSS粉末溶于高壓滅菌蒸餾水配制成2.5%DSS溶液，實驗組1小鼠自由飲用2.5%DSS溶液7 d后飲用蒸餾水14 d，如此循環3次，末次給藥后第5天處死小鼠，對照組1小鼠全程自由飲用蒸餾水。每天觀察記錄小鼠的體質量、糞便性狀和糞便帶血情況。于第54天斷頸處死兩組小鼠，解剖取出完整結腸，取2 cm遠端結腸，用4%多聚甲醛溶液固定后行病理檢查。將剩余結腸組織保存于-80 ℃冰箱備用。

1.5 構建小鼠急性結腸炎模型

將小鼠分為對照組2(WT小鼠)、實驗組2(WT小鼠+3%DSS)和實驗組3(KDM5C-/-小鼠+3%DSS)，每組3只小鼠。參照Bauer等[10]的方法構建小鼠急性結腸炎模型。將DSS粉末溶于高壓滅菌蒸餾水配制成3%DSS溶液，實驗組2和實驗組3小鼠給予自由飲用3%DSS溶液7 d，對照組2全程自由飲用蒸餾水。每天觀察并記錄各組小鼠的體質量、糞便性狀和糞便帶血情況、毛色及活動狀況。疾病活動指數評分(DAI)參照Wirtz 等[11]的評分標準，詳見表1。于第8天斷頸處死各組小鼠，取完整結腸，測量長度并拍照。取2 cm遠端結腸，用4%多聚甲醛溶液固定后行病理檢查。將剩余結腸組織保存于-80 ℃冰箱備用。

表1 DAI評估標準

1.6 小鼠結腸組織切片制備

處死小鼠后取0.5 cm遠端結腸，置于4%多聚甲醛溶液中固定，經乙醇脫水，先行透明處理，再完成浸蠟、包埋、切片、烤片和切片脫蠟處理。脫蠟蒸餾水浸洗2 min后行H-E染色，染色完成后自來水洗滌，透明，封片。最后進行鏡檢及圖像采集分析。

1.7 real-time qPCR檢測

將收集的人體結腸標本、急性和慢性結腸炎模型小鼠的結腸組織稱重，按照EASY spin組織/細胞RNA快速提取試劑盒操作說明書提取總RNA，根據OD260/OD280比值估測RNA質量，比值在1.8～2.0滿足實驗要求。取2 μg總RNA為模板逆轉錄成cDNA，高壓滅菌蒸餾水稀釋2倍，以GAPDH為內參，Real-time qPCR法檢測KDM5C、TNF-α、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-6和IL-1βmRNA的相對表達量。逆轉錄反應條件：65 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min。real-time qPCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 min，56 ℃～64 ℃退火30 s，72 ℃延伸，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。每個實驗至少重復3次，real-time qPCR引物序列見表2。

表2 引物序列

1.8 生物信息學數據獲取

利用生物信息學技術分析KDM5C在IBD患者和正常人腸黏膜中的差異表達情況，從GEO數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載IBD基因芯片數據集GSE6731，由Chakravarti等提交，共36個樣本，包括13例UC患者、19例CD患者的腸黏膜組織及4名正常人的腸黏膜組織(正常對照者)。

1.9 統計學分析

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統計學分析，數據以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IBD患者及正常對照者結腸組織中的KDM5C mRNA表達比較

利用Graphpad Prism 8.0軟件對GSE6731數據集進行分析，結果顯示與正常對照者相比，UC、CD患者結腸組織中的KDM5CmRNA相對表達量均明顯降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)，見圖1A。采用real-time qPCR法檢測UC、CD患者及結腸息肉患者(正常對照)的結腸組織，發現與結腸息肉患者相比，UC和CD患者結腸組織中的KDM5CmRNA相對表達量均明顯降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)，與生物信息學分析結果一致，見圖1B。

2.2 慢性結腸炎模型小鼠結腸組織中的KDM5C mRNA相對表達量比較

采用real-time qPCR法檢測實驗組1和對照組1小鼠結腸組織中的KDM5CmRNA相對表達量，結果顯示實驗組1小鼠結腸組織中的KDM5CmRNA相對表達量顯著低于對照組1，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

注：與正常對照者比較，*P<0.05圖1 UC、CD患者和正常對照者結腸組織中的KDM5C mRNA表達量比較 A GSE6731數據集分析 B real-time qPCR法測得的3組KDM5C mRNA相對表達量比較

注：與對照組1比較，*P<0.05圖2 兩組小鼠結腸組織中的KDM5C mRNA相對表達量比較

2.3 急性結腸炎模型小鼠疾病表現和炎性反應評估

本研究采用KDM5C-/-小鼠進一步研究KDM5C在結腸炎中的作用，結果顯示與對照組2相比，實驗組2的體質量在第3天開始持續下降，實驗組3的體質量下降更為顯著；第5天時實驗組3與對照組2的的體質量差異顯著(P<0.05)，第8天時實驗組2與實驗組3的體質量差異顯著(P<0.05)；見圖3A。此外，與對照組2相比，實驗組2的DAI明顯升高，實驗組3的DAI升高更顯著，且在第8天時實驗組2與實驗組3的DAI差異顯著(P<0.05)，見圖3B。于構建急性結腸炎模型第8天處死小鼠，分離出完整的結腸組織，觀察大體組織學改變：與對照組2相比，實驗組2大便稀軟，結腸長度明顯縮短且腸腔變細、僵硬和出血；實驗組3腸腔出血和結腸縮短較實驗組2更顯著；見圖3C、3D。結腸組織經H-E染色后光鏡下觀察(×100)示：與對照組2相比，實驗組2小鼠結腸腺體結構紊亂、隱窩結構破壞，黏膜和黏膜下層水腫并伴有炎性細胞浸潤；在實驗組3小鼠腸組織中，這些炎性反應表型更為明顯；見圖3E。

注：與對照組2比較，*P<0.05；與實驗組3比較，#P<0.05；與實驗組2比較，+P<0.05圖3 3組小鼠的疾病表現和炎性反應評估比較 A 體質量下降曲線 B DAI C 結腸長度 D 完整結腸標本 E 遠端結腸病理圖 H-E染色 ×100

2.4 KDM5C基因敲除對炎性因子表達的影響

為進一步研究KDM5C基因敲除加重結腸炎的潛在機制，本研究采用real-time qPCR法檢測了急性結腸炎模型小鼠結腸組織中一些炎性因子mRNA相對表達量，結果顯示，與對照組2相比，實驗組2的KDM5CmRNA相對表達量明顯下降，實驗組3的KDM5CmRNA相對表達量極低，提示敲除成功；實驗組2結腸組織中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β的mRNA相對表達量均較對照組2明顯升高(P均<0.05)；實驗組3小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA相對表達量較實驗組2進一步升高(P均<0.05)，而IFN-γ的mRNA相對表達量較實驗組2也有所升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

注：與對照組2比較，*P<0.05；與實驗組2比較，+P<0.05圖4 3組小鼠結腸組織中炎性因子mRNA相對表達量的比較 A KDM5C B TNF-α C IFN-γ D IL-6 E IL-1β

3 討論

近年來，越來越多的研究顯示表觀遺傳修飾是免疫相關的炎性疾病的重要發病機制之一[12-13]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA可顯著緩解小鼠的慢性結腸炎和腹膜纖維化[14-15]。在DSS誘導的急性結腸炎小鼠體內注射組蛋白甲基化酶EZH2抑制劑，可增加骨髓來源的抑制性細胞(MDSC)富集，對緩解結腸炎及預防結腸炎相關結直腸癌有良好的療效[16]。關于組蛋白去甲基化酶KDM5C在IBD中的作用尚未見研究報道。本研究發現在IBD患者和經DSS誘導的慢性結腸炎模型小鼠結腸組織中KDM5C轉錄水平均明顯降低，提示KDM5C在結腸炎中可能發揮抑炎作用。進一步構建急性結腸炎模型，結果發現KDM5C-/-小鼠對DSS誘導的結腸炎較WT小鼠更易感，具體表現為小鼠體質量下降更快、DAI更高、結腸出血及縮短更明顯、腸黏膜損傷更重。由此可見，KDM5C基因缺失加重了腸道炎性反應，提示KDM5C在IBD發病過程中發揮著抗炎作用。

腸黏膜免疫應答紊亂導致的細胞因子失衡是IBD發生、發展的核心環節。組蛋白修飾除了直接調控基因表達外，還與免疫調節、炎性反應等多種生物學功能有關。JMJD3是組蛋白H3K27的去甲基化酶，不僅參與Th17細胞的分化，還可促進巨噬細胞向M2型極化[17-18]。在脂多糖(LPS)刺激的巨噬細胞中，TET2通過招募組蛋白去乙酰化酶HDAC1/2，下調IL-6的表達，從而抑制炎性反應持續發展[19]。He等[20]發現泛素連接酶FBXW7可通過靶向降解EZH2增加CCL2、CCL7等趨化因子在結腸固有層聚集，從而加重腸道炎性反應。上述研究均證明組蛋白修飾可通過調節炎性因子參與IBD的發生、發展。近年來研究顯示長鏈非編碼RNA LOXL1-AS1通過KDM5C上調IL-6、IL-8的表達，從而加重骨關節炎[21]。TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β等炎性因子的過量產生與腸黏膜屏障損傷及腸道慢性炎性反應密切相關，抗TNF-α單抗已成為治療IBD的重要手段并取得良好療效，被納入了國內外IBD治療指南[22-23]。本研究采用real-time qPCR法檢測了小鼠結腸組織中一些炎性因子mRNA的相對表達量，結果發現KDM5C基因缺失可誘導結腸組織中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達量明顯升高，與上述結論一致，提示KDM5C可通過抑制炎性因子表達而發揮抗炎作用。

綜上所述，KDM5C基因敲除可加重DSS誘導的結腸炎，這種效應可能是通過上調促炎因子的表達而實現的。本研究為進一步探討KDM5C在結腸炎發病機制中的作用提供了依據和線索。然而，本研究尚存在不足：(1)KDM5C基因敲除后上調TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表達是否通過調節H3K4三甲基化發揮作用，有待進一步研究；(2)本研究中KDM5C基因敲除小鼠數量較少，因全身性KDM5C基因敲除小鼠存在發育遲緩和雌性純合子致死的問題，今后本課題組將培育更多的雄性純合子KDM5C-/-小鼠，通過模式動物深入研究其在腸道炎性反應中的作用及具體機制。