胃癌患者的CD1D基因甲基化異化及其臨床意義

宋 健 袁桂紅 陳昭偉 黎 萍 王發保 胡飛翔 張榮琳 王俞雅

胃癌在中國惡性腫瘤發病率中居第2位，病死率居第1位[1]。目前尚無有效的早期診斷方法，診斷金標準仍是胃鏡檢查，由于胃鏡檢查的依從性、可行性及社會經濟效益比不理想，故不能作為胃癌篩查及早期診斷的有效方法[2]。目前亟需尋找到新的無創性且敏感度和特異度較高的胃癌診斷方法。近年來腫瘤特異的DNA甲基化分子靶標成為研究的熱點，美國FDA在2014年已批準結腸癌特異性的甲基化診斷試劑盒應用于臨床，取得了較好的診斷效果[3]。然而，胃癌特異性的甲基化分子靶標方面的研究不多，尚未發現可用于臨床的甲基化分子靶標[4-5]，近年來研究通過甲基化基因芯片篩查發現，CD1D基因在胃癌患者中呈高甲基化狀態[6]，但其能否作為胃癌診斷的分子靶標尚未見文獻報道。本文針對胃癌、慢性非萎縮性胃炎及慢性萎縮性胃炎患者的病理組織及胃液中CD1D基因甲基化水平進行研究，旨在探討CD1D基因甲基化異化作為胃癌診斷分子靶標的可能性，以及胃液能否作為其檢測標本，以期為胃癌的早期診斷及預后評估提供策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例入組及標本取材 本研究選擇2017年1月至2018年8月海南省腫瘤醫院內鏡中心診治的77例胃癌及慢性胃炎患者，其中男性40例，女性37例，年齡35～75歲，平均年齡(56.28±13.85)歲。胃癌組37例，包含早期胃癌15例和進展期胃癌22例。慢性胃炎患者40例，分為慢性非萎縮性胃炎組(20例)和慢性萎縮性胃炎組(20例)。胃癌的診斷標準參照《中國臨床腫瘤學會(CSCO)原發性胃癌診療指南(2017.V1)》[7]，胃炎的診斷標準參照《中國慢性胃炎共識意見(2017年，上海)》[8]。所有患者在入組前均未接受放射治療、化學治療及生物免疫治療，并排除患有其他系統腫瘤、其他胃腸疾病及其他器官衰竭的患者。入組患者胃鏡活組織檢查標本及胃液標本的留取及保存參照既往文獻[9]，胃癌患者取胃癌組織及癌旁組織標本(距離腫瘤邊緣>5 cm)。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意?；颊叩囊话阗Y料見表1，各組年齡、性別之間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 患者的一般情況比較

1.1.2 儀器和試劑 LG16-WA型離心機(北京京立離心機有限公司)，DYY-6C型凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)，MG96+型PCR擴增儀(杭州郎基科學儀器有限公司)，SC805型凝膠成像儀(上海山富科學儀器有限公司)。DNA甲基化亞硫酸鹽修飾試劑盒：EZ DNA Methylation-GoldTMKit(美國Zymo Research公司，Catalog Nos.D5005)；DNA甲基化PCR擴增試劑盒：ZymoTaq PreMix(美國Zymo Research公司，Catalog Nos.E2003)；快速DNA提取試劑盒：Quick-DNATMUniversal Kit(美國Zymo Research公司，Catalog Nos.D4068)。

1.2 方法

1.2.1 各組胃組織及胃液DNA的提取 將各組胃活組織樣本保存在DNA保護劑中，提取DNA。將各組胃液于4 ℃離心10 min(1 000 r/min)，取上清液再次于4 ℃離心20 min(10 000 r/min)，留取沉淀物用于DNA抽提。采用快速DNA提取試劑盒，操作步驟嚴格按照說明書進行。DNA純度分析采用核酸蛋白分析儀，采用凝膠電泳進行質量檢測。

1.2.2 DNA的亞硫酸鹽修飾 將各組胃組織及胃液DNA進行亞硫酸鹽修飾，采用DNA甲基化亞硫酸鹽修飾試劑盒，操作步驟嚴格按照說明書進行。針對修飾前后的序列差異，采用MethPrimer軟件設計甲基化及非甲基化PCR擴增引物，引物序列見表2。

表2 引物序列

1.2.3 甲基化特異性PCR 將修飾后的各組DNA進行甲基化特異性PCR(MSP)擴增。PCR反應采用DNA甲基化PCR擴增試劑盒，反應體系為25 μL，反應條件為：95 ℃，預變性5 min，循環體系94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行40個循環，之后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用雙蒸水作為空白對照。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗；計數資料以例(%)表示，采用卡方檢驗、Mann-Whitney U 檢驗及Fisher′s精確檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組病理組織中CD1D基因甲基化水平比較

各組病理組織中CD1D基因MSP電泳結果見圖1。慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組及癌旁組CD1D基因甲基化異化率分別為25.0%(5/20)、35.0%(7/20)、86.5%(32/37)、56.8%(21/37)。胃癌組的病理組織中CD1D基因甲基化異化率與慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、癌旁組之間的差異有統計學意義(P<0.01)，慢性非萎縮性胃炎組與萎縮性胃炎組之間差異無統計學意義(P>0.05)。早期胃癌與進展期胃癌患者的胃癌組織中CD1D基因甲基化異化率分別為66.7%(10/15)、100.0%(22/22)，兩者之間的差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組胃組織中CD1D基因MSP電泳結果 A 慢性非萎縮性胃炎組 B 慢性萎縮性胃炎組 C 胃癌組 D 癌旁組

2.2 各組胃液中CD1D基因甲基化水平比較

各組胃液中CD1D基因MSP電泳結果見圖2。慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組的胃液DNA中CD1D基因甲基化異化率分別為0(0/20)、5.0%(1/20)、54.1%(20/37)，胃癌組較前兩者升高，差異有統計學意義(P<0.01)，慢性非萎縮性胃炎組與慢性萎縮性胃炎組之間差異無統計學意義(P>0.05)。早期胃癌與進展期胃癌患者的胃液中CD1D基因甲基化異化率分別為33.3%(5/15)、68.2%(15/22)，兩者之間的差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 各組胃液中CD1D基因MSP電泳結果 A 慢性非萎縮性胃炎組 B 慢性萎縮性胃炎組 C 胃癌組

2.3 胃癌組織中CD1D基因甲基化異化與臨床病理特征的關系

相關性分析顯示，胃癌患者的胃癌組織中CD1D基因甲基化異化與胃癌臨床分期顯著相關(P<0.05)，與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤發生部位及淋巴結轉移無顯著相關性(P>0.05)。見表3。

表3 胃癌組織中CD1D基因甲基化異化與臨床病理特征的關系

3 討論

DNA甲基化異化在腫瘤的發生、發展中起著重要作用，目前在部分腫瘤的診斷及預后評估中具有較高的臨床價值[10]。DNA甲基化在胃癌中的相關研究較多[11-14]，但目前尚未見明確可靠的甲基化分子靶標用于胃癌診斷的文獻報道。CD1D基因是CDl家族中的成員，在B細胞亞群、胸腺細胞、樹突狀細胞亞群中表達豐富，CDl分子是獨立于主要組織相容性復合體(MHC)分子之外的一類特殊的抗原遞呈分子[15]，它遞呈的抗原主要為脂質分子，供NKT細胞識別，在免疫調節、NKT細胞發育、感染性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤的發生、發展中起著重要作用[16-20]。2018年Anderson等[6]的研究通過兩個中心全基因組甲基化基因芯片篩查及胃癌蠟塊組織驗證，發現CD1D基因在胃癌中呈高甲基化狀態，兩個中心診斷胃癌的AUC分別為0.94(95%CI：0.88～0.99)、0.91(95%CI：0.84～0.98)，敏感度分別為89%(95%CI：0.73～0.97)、86%(95%CI：0.73～0.94)。但因其驗證的病理組織樣本量較小，兩個中心的胃癌蠟塊組織分別為35例、36例，未在真實病例中進行研究，故該研究結果仍需進一步研究證實。此外，CD1D基因在食管癌中的甲基化異化情況尚未見文獻報道[21]，其是否具有胃癌特異性仍需進一步研究明確。

胃液中含有大量胃黏膜脫落細胞及其DNA，易于獲取，是進行胃癌分子診斷的良好標本，通過胃管法獲取胃液進行胃癌分子靶標的檢測，對于人群的胃癌篩查具有更高的依從性和社會經濟效益比。2016年Yamamoto等[22]的研究顯示，胃液可用作胃癌甲基化異化分子靶標的檢測標本。

本研究探討了CD1D基因在胃癌患者的胃癌和癌旁組織，慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎患者的病理組織，以及3類患者的胃液中的甲基化異化情況，并分析了CD1D基因甲基化異化與胃癌患者臨床病理特征的關系。本研究結果表明，胃癌患者的胃癌組織及胃液DNA中CD1D基因啟動子區均呈高甲基化狀態，有較高的一致性，CD1D基因甲基化異化在胃癌早期即有發生。在慢性非萎縮性和慢性萎縮性胃炎患者中有少量CD1D基因甲基化異化發生，兩組均與胃癌組差異顯著。在胃癌組織中CD1D基因甲基化異化率高達86.5%，癌旁組織中的甲基化異化率也較高(56.8%)，發生甲基化異化的機制尚不清楚。本研究結果提示CD1D基因甲基化異化具有潛在的作為胃癌診斷的分子靶標的可能。CD1D基因在萎縮性胃炎患者病理組織中的甲基化異化率為35%，提示CD1D甲基化異化可能對胃癌的發生有一定的預警作用。本研究的相關性分析顯示，胃癌患者胃癌組織中CD1D基因啟動子區甲基化異化與腫瘤的分期相關，分期越晚則甲基化異化率越高，而與年齡、性別、腫瘤發生部位及淋巴結轉移等無顯著相關性。

綜上所述，CD1D基因在胃癌組織中呈高甲基化狀態，并且在早癌胃癌中即有較高的甲基化異化率，檢測胃液中CD1D基因甲基化異化情況有助于胃癌風險的預測及早期診斷，CD1D基因甲基化異化具有潛在的成為胃癌診斷分子靶標的可能，但仍需進一步研究驗證并建立特異性的高效檢測方法。