食管鱗癌中CD137L表達及其與腫瘤轉移和微血管密度的相關性

安秀英 胡鋒超 張 晶 王 萍 竇 艷 張華英

食管鱗癌是指食管上皮鱗狀細胞分化的惡性上皮性腫瘤，占食管癌95%，其發病率和病死率均較高，具體病因不明，可能與遺傳、飲食習慣、抑癌機制缺陷等有關，目前治療方式包括手術治療、化學治療、放射治療及免疫治療等[1-2]。CD137配體(CD137L)通過控制T細胞的轉移、凋亡、殺傷毒性等達到抗腫瘤的效果，已成為食管鱗癌免疫治療的研究熱點[3-4]。CD105是獨立存在于細胞表面的腫瘤新生血管的重要標志物[5]。雖然學者們已經開展了CD137/CD137L靶向治療、腫瘤微血管密度(MVD)等的研究[6-7]，但在食管鱗癌中CD137L蛋白表達與腫瘤轉移及MVD的相關性方面鮮見報道。本研究比較了80例食管鱗癌患者的鱗癌組織和癌旁正常組織中CD137L、CD105蛋白的表達并分析CD137L表達與MVD的相關性，探討CD137L表達對腫瘤轉移及MVD的意義，為免疫治療研究、食管腫瘤進展機制研究提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2018年6月在河北省民政總醫院外科住院手術的80例食管鱗癌患者的食管鱗癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)進行回顧性分析。男性45例，女性35例，年齡18～75歲，平均年齡為(57.38±6.94)歲。納入標準：(1)首次就診，未經其他治療；(2)未見食管以外的腫瘤病灶；(3)經病理檢查確診為食管鱗癌，病理切片可見角質細胞樣細胞之間存在細胞間橋，或伴有角化珠，患者腫瘤組織均存于本院病理科；(4)溝通交流無障礙。

1.2 方法

1.2.1 定量PCR檢測 組織裂解后制備成勻漿，提取總RNA，制備實時熒光定量反應體系，進行定量PCR(qPCR)檢測。qPCR反應程序：95 ℃ 3 min變性，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共40個循環。檢測食管鱗癌組織及癌旁正常組織中CD137LmRNA的相對表達量，以β-actin為內參，以2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。所有操作步驟均嚴格按說明書進行。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 組織切片制備與觀察 食管鱗癌組織和癌旁正常組織用4%中性甲醛固定4～6 h，組織經常規處理，包埋，切片，展平，烤片。光鏡下復閱石蠟切片，重新診斷。記錄腫瘤臨床病理特征，包括組織學分級(Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級)，浸潤深度(黏膜內、肌層、外膜)，有無淋巴結轉移等，由兩位病理醫師判定結果。組織學分級參照《安徽省食管癌分級診療指南(2016版)》[8]：(1)Ⅰ級 癌細胞分裂有層次，癌巢中有明顯角化珠、細胞內角化、發育良好的細胞問橋；(2)Ⅱ級 癌細胞分界尚清，癌巢周邊核呈柵狀排列，有細胞內角化及個別角化珠；(3)Ⅲ級 癌細胞大小不等，細胞間橋不明顯，核異型性明顯，核分裂多伴壞死。

1.2.3 免疫組織化學染色與各指標檢測 每例蠟塊連續切片，采用免疫組織化學SP法檢測食管鱗癌組織及癌旁正常組織中CD137L、CD105蛋白的表達，操作步驟嚴格按說明書進行。依據染色強度及陽性細胞占比，分為陽性表達和陰性表達，由兩位病理醫師判定結果。陽性細胞：細胞膜、細胞質中可見黃色或棕黃色顆粒。每例切片在400倍光鏡下隨機選擇5個視野，進行陽性細胞數占比計分(每個視野計數100個細胞)：<5%計0分；>5%且≤25%計1分；>25%且≤50%計2分；>50%且≤75%計3分；>75%計4分。依據陽性細胞著色程度計分：無著色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；褐黃色計3分。5個視野得分取均值，兩種得分相乘得出免疫組織化學評分(IHS)：0～1分為陰性表達；2～12分為陽性表達。MVD計算：4倍光鏡下選擇3個CD105蛋白表達熱區，于10倍光鏡下計數CD105標記的微血管，取3個視野的均值作為MVD值[3,5]。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計數資料用例(%)表示，食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的CD137LmRNA、CD137L蛋白陽性表達比較分別采用t檢驗和χ2檢驗。不同臨床病理特征的食管鱗癌組織中CD137L蛋白陽性表達率比較采用χ2檢驗。兩種組織中MVD比較采用t檢驗。采用Pearson法分析食管鱗癌組織中CD137LmRNA表達量與MVD的相關性，檢驗水準為α=0.05，P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 兩種組織中CD137L mRNA和蛋白表達比較

采用qPCR法檢測80例食管鱗癌組織和對應癌旁正常組織中的CD137LmRNA相對表達量，結果顯示食管鱗癌組織中的CD137LmRNA相對表達量低于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)；免疫組織化學染色結果顯示，食管鱗癌組織中CD137L蛋白主要表達在細胞膜，少量表達在細胞質，蛋白陽性表達率顯著低于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2和圖1。

表2 兩種組織中的CD137L mRNA和蛋白表達比較

圖1 兩種組織中的CD137L蛋白表達病理圖 免疫組織化學染色SP法 ×400 A 食管鱗癌組織 B 癌旁正常組織

2.2 食管鱗癌組織中CD137L蛋白表達與臨床病理特征的關系

如表3所示，浸潤深度越深，則CD137L蛋白陽性表達率越低，有淋巴結轉移患者的CD137L蛋白陽性表達率低于無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義(P均<0.05)。

表3 食管鱗癌組織中CD137L蛋白表達與臨床病理特征的關系

2.3 兩種組織中MVD比較

采用CD105標記MVD，免疫組織化學法結果顯示，CD105蛋白主要表達于血管內皮細胞，食管鱗癌組織中的MVD顯著高于癌旁正常組織[(36.92±6.55)/mm2比(10.17±2.12)/mm2]，差異有統計學意義(t=10.002，P=0.000)。見圖2。

圖2 兩種組織中CD105標記的MVD病理圖 免疫組織化學染色SP法 ×400 A 食管鱗癌組織 B 癌旁正常組織

2.4 食管鱗癌組織中CD137L表達與MVD的相關性

比較食管鱗癌組織中CD137L蛋白陽性表達患者與陰性表達患者的MVD，結果顯示前者的MVD顯著低于后者[(31.94±6.13)/mm2比(41.77±6.08)/mm2]，差異有統計學意義(P<0.05)。采用Pearson法分析CD137LmRNA相對表達量與MVD的相關性，結果發現，CD137LmRNA相對表達量與MVD呈顯著負相關(r=0.492，P=0.000)。

3 討論

食管癌是臨床上較為常見的惡性腫瘤，在中國，其發病率居惡性腫瘤第9位，病死率居惡性腫瘤第4位，惡性程度較高[9]。國外研究顯示多數食管癌為腺癌[10]，而國內研究顯示95%的食管癌為鱗癌[11]，國內外食管癌組織來源的不同可能與國內外人群遺傳差異、飲食習慣不同等因素相關。雖然目前對食管癌患者采用以手術為主，輔以化學治療、放射治療、中藥治療及對癥治療等治療方式，但其5年生存率仍低于40%[8,12]。近年來開展了針對性較強的免疫治療，其機制為激活免疫調節分子增強機體的抗腫瘤反應。調節免疫反應的免疫因子又稱為協同刺激分子[13-14]，相關研究表明CD28/B7均為重要的協同刺激分子，而CD137為目前較新的研究熱點，CD137L為CD137的配體，表達于多數實體腫瘤細胞上，是一種Ⅱ型跨膜蛋白，多數學者認為腫瘤組織中CD137L低表達和不表達是腫瘤免疫逃逸的機制之一[15-17]。CD137與CD137L結合可刺激多條信號通路，激活免疫反應，參與多種腫瘤的發生，如非小細胞肺癌、胰腺癌、食管癌等[18-19]。然而，相關研究中均未對食管鱗癌中CD137L表達及其與腫瘤轉移和MVD的相關性進行闡述。因此，本研究通過比較80例食管鱗癌患者的鱗癌組織和對應癌旁正常組織中CD137L、CD105表達并分析CD137L表達與MVD的相關性，旨在探討CD137L表達對腫瘤轉移及MVD的意義。

本研究采用qPCR法檢測80例食管鱗癌及其對應癌旁正常組織中CD137LmRNA的相對表達量，結果發現食管鱗癌組織中CD137LmRNA的相對表達量顯著低于癌旁正常組織；免疫組織化學結果顯示，食管鱗癌組織中CD137L蛋白主要表達在細胞膜，少量表達在細胞質，可觀察到黃色或棕黃色顆粒，CD137L蛋白陽性表達率顯著低于癌旁正常組織，其分子機制不明。研究表明，細胞膜表面蛋白與免疫因子結合是引起免疫清除的重要因素，腫瘤細胞膜表面蛋白通常不表達或低表達，以逃逸免疫監視，在腫瘤發生、發展階段具有重要意義[20]。本研究顯示，食管鱗癌組織中CD137LmRNA和蛋白的表達均低于癌旁正常組織，與該研究結論相符。

本研究分析了食管鱗癌組織中CD137L蛋白表達與臨床病理特征的關系，發現腫瘤浸潤深度越深，CD137L蛋白陽性表達率越低，有淋巴結轉移的患者的CD137L蛋白陽性表達率低于無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義(P均<0.05)。浸潤程度較深、有淋巴結轉移，提示患者腫瘤分期較高，預后較差。本研究中結果提示CD137L蛋白低表達患者的預后較差，生存率較低。因此，可將CD137L作為判斷病情及預后的指標。

研究表明MVD是評估腫瘤內微血管形成的重要指標。本研究中免疫組織化學結果顯示，CD105蛋白主要表達于血管內皮細胞，食管鱗癌組織中MVD顯著高于癌旁正常組織(t=10.002，P=0.000)。腫瘤內血管形成對于腫瘤的發生、發展及轉移具有重要意義。通常血管的豐富程度反映了腫瘤的發展速度，且血供越豐富，則腫瘤經血液及淋巴轉移的可能性越大。因此，MVD也可作為判斷腫瘤患者預后的重要指標。研究表明，MVD升高提示腫瘤內新生血管增多，尤其是轉移的淋巴結組織中血管增多，血供增加，腫瘤侵襲能力增強，導致患者預后不良[21]。

CD137L表達越低預示腫瘤惡性程度越高，患者預后越差；MVD越高預示腫瘤侵襲能力越強，患者預后越差。本研究分析了食管鱗癌組織中CD137L表達與MVD的相關性，結果顯示CD137L蛋白陽性表達患者的MVD顯著低于CD137L蛋白陰性表達患者(P<0.05)。采用Pearson法分析CD137LmRNA相對表達量與MVD的相關性，結果發現，CD137L mRNA相對表達量與MVD呈顯著負相關(r=0.492，P=0.000)。機體免疫監視的強度、腫瘤血供的豐富程度均為腫瘤發展、轉移的重要評價指標。CD137L表達與免疫監視的強度相關，MVD是腫瘤微血管形成的評價指標。研究表明CD137與CD137L結合后具有活化、刺激、趨向、增強T細胞的作用[15,20]。因此，CD137L蛋白陽性與陰性表達患者的腫瘤MVD存在差異，且CD137LmRNA低表達、MVD高表達的患者預后不良。

綜上所述，食管鱗癌組織中CD137L主要表達在細胞膜，少量表達在細胞質。CD137L在食管鱗癌組織中呈低表達，與腫瘤轉移及MVD密切相關，可為臨床免疫治療研究、食管腫瘤進展機制研究提供理論基礎。