鴨坦布蘇病毒病RT-PCR檢測方法的建立

元正菊，王巧萍、2，張信艷、3，嚴紅亞，李珂，趙蓉，常志順，王傳禹，信愛國*

(1.云南省畜牧獸醫科學院養禽與禽病研究所，云南 昆明 650224；2.云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201； 3.水富市畜牧獸醫技術推廣站，云南 水富 657800)

鴨坦布蘇病是由鴨坦布蘇病毒(Duck tembusu virus, DTMUV)感染蛋鴨和種鴨的一種新發傳染病。該病可感染不同品種的鴨，患病鴨采食量、產蛋量急劇下降，剖檢可見出血性卵巢炎。該病自2010年在中國發生以來，傳播迅速，是危害養鴨業較嚴重的傳染病之一[1]。2019年在云南省宜良縣某種鴨場發現疑似病例，患病鴨表現站立不穩、癱瘓等神經癥狀；剖檢可見卵巢充血、出血，卵泡變性、破裂，脾臟腫大，后經云南省畜牧獸醫科學院養禽與禽病研究所確診為鴨坦布蘇病毒感染所致[2]。目前，該病在云南省主要水禽養殖區域傳播的風險極高，建立快速、準確的病原檢測技術，實施DTMUV病原監測，對防控該病具有重要意義。

DTMUV基因組為單股正鏈RNA病毒，大小約為10 990 nt，包含一個開放讀碼框(ORF)，編碼3種結構蛋白(核衣殼蛋白C、膜蛋白PrM/M和包膜蛋白E)和7種非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)[3]。目前，常規 RT-PCR 方法檢測DTMUV的報道中，主要參照黃病毒科黃病毒屬的NS5基因[4]或E蛋白基因[5]片段序列設計引物，或者針對DTMUV的E蛋白基因[6-8]片段設計引物建立檢測方法。病毒E蛋白是病毒的重要毒力蛋白，也是重要的免疫原性蛋白，能誘導產生中和抗體[9]，NS5 為黃病毒中最保守的非結構蛋白，具有RNA依賴的 RNA 聚合酶活性。

在云南水禽主要養殖區，臨床診斷結合病例剖檢發現 DTMUV 疑似病例，但臨床上需與其他疫病鑒別診斷。為了解云南地區 DTMUV 感染流行情況，參閱已有的DTMUV快速檢測方法以及分子流行病學研究文獻，針對DTMUV建立RT-PCR檢測方法，并應用于云南鴨臨床樣品的診斷檢測研究。

1 材料與方法

1.1 病毒株

鴨坦布蘇病毒YN2019株BHK-21細胞適應毒由本研究所分離保存。新城疫病毒( Newcastle disease virus，NDV) 、減蛋綜合征病毒( Chicken egg down syndrome virus，EDSV) 、I型和III型鴨肝炎病毒 ( Duck hepatitis virus，DHV) 、傳染性法氏囊病毒( Infectious bursal disease virus，IBDV) 、禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)均由本研究所提供，H5/H7/H9亞型禽流感病毒( Avian influenza virus，AIV)滅活抗原購買于華南農大生物藥品有限公司。

1.2 引物

根據已發表的DTMUV NS5蛋白基因序列，采用Vector NTI 8.0序列分析軟件做對比分析，利用 Primer 5.0 軟件自主設計了1 對針對NS5基因的檢測引物；同時，參考文獻[10]合成1對針對DTMUV E蛋白的檢測引物作為平行檢測引物，建立同時針對E基因和NS5基因的檢測體系。引物序列見表1。引物由碩擎生物科技有限公司合成。稀釋成工作濃度( 10 pmol/L)-20 ℃保存備用。

表1 DTMUV引物信息表

1.3 病毒核酸提取

采用寶生物工程(大連)有限公司生產的病毒RNAiso Plus試劑提取DTMUV及其他病毒RNA；按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit說明書分別提取EDSV和FAdV的DNA，-80℃保存備用。

1.4 RT-PCR方法的建立

采用寶生物工程(大連)有限公司生產的PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit 建立一步RT-PCR方法檢測DTMUV。RT-PCR反應總體系50μL，包括PrimeScript OneStep Enzyme Mix 2.0 μL，2× OneStep Buffer(Dye plus) 25.0μL,上下游引物各1.0μL，Total RNA 2.0μL，RNase-free ddH2O 19.0μL。反應程序為：50℃逆轉錄30min，94℃預變性2min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共進行 35個循環；最后72℃延伸15min，4℃冷卻。PCR結束后取5μL擴增產物進行1.5% 瓊脂糖凝膠100V電泳30min,然后用凝膠成像系統觀察結果。

1.5 特異性實驗

用確定的最佳條件分別對陽性對照及其他相關的幾種病毒進行RT-PCR檢測，評價擴增DTMUV的特異性。同時膠回收陽性樣品718bp的擴增產物條帶送測序，結果提交NCBI網站，用Blast n 程序在線比對分析，驗證其特異性。

1.6 敏感性實驗

將提取的DTMUV-YN2019株細胞毒RNA測定濃度后，10倍梯度連續稀釋，按上述RT-PCR方法進行擴增，測定模板最低檢出量，判定該方法的敏感性。

1.7 重復性實驗

用建立的RT-PCR檢測方法對YN2019株細胞毒和1份DTMUV陽性樣品重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩定性。

1.8 臨床樣品的檢測

將云南不同地區養鴨場收集的20份產蛋下降臨床疑似樣品，每份取約5.0g剪碎后加入4倍體積的PBS(pH7.2)研磨，反復凍融3次后，離心取上清提取總RNA，進行DTMUV的RT-PCR方法檢測，并對部分樣品的擴增產物進行測序驗證。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR擴增條件及產物

以DTMUV-YN2019株細胞毒提取的病毒RNA為模板，進行一步法 RT-PCR擴增，經優化的退火溫度為56℃，引物濃度為10pmol/μL，擴增35個循環。針對NS5設計的引物能成功擴增出718bp大小的預期目的片段，與針對E基因擴增出483bp片段檢測結果一致(圖1)。

A. NS5基因片段擴增結果。M.DL2000 Marker; 1.陰性對照;2-4. DTMUV細胞毒擴增結果; 5.空白對照。B.E基因片段擴增結果。M.DL2000 Marker; 1-3.DTMUV細胞毒擴增結果。

2.2 特異性實驗分析

本研究建立的RT-PCR 對DTMUV可擴增出718bp的目的條帶，而對NDV、AIV(H5、H7、H9抗原)、EDSV、DHV、IBDV、FAdV則無擴增條帶，陽性樣品718bp的擴增產物條帶經膠回收、測序，結果用NCBI網站的Blast n 程序在線比對分析，表明該核酸序列源于DTMUV基因組，說明該方法具有極高的特異性。

2.3 重復性實驗分析

經過3次重復檢測，試驗結果完全一致，說明本研究建立的方法穩定性較好。

2.4 敏感性實驗分析

將提取的YN2019細胞毒 RNA(濃度為32.4ng/μL) 連續10倍稀釋后進行RT-PCR檢測，結果見圖2。檢出的最低稀釋度為1×10-3，則其敏感度為3.24pg/μL。

M.DL2000 Marker ; 1.1×100;

2.5 臨床樣品檢測結果

將云南不同地區養鴨場收集的20份產蛋下降臨床疑似樣品提取RNA后進行RT-PCR方法檢測，結果測定為陽性的有10份，其陽性率為50%，10個擴增產物的測序結果與NS5基因序列(登錄號為KJ958533)的同源性為100%。

3 討論

DTMUV是最近10年在我國開始傳播的一種新發傳染病，主要危害鴨和鵝，給養殖戶帶來極大損失，所以該病的檢測和預防極其重要。該病多發生于產蛋鴨群，表現為鴨群突然出現采食下降，隨后產蛋量急劇下降，剖檢病鴨可見明顯的卵泡出血和變性。在臨床實踐中，首先排除由于環境、飼料、藥物以及飼養管理因素和其他可引起鴨產蛋量急劇下降的傳染性疾病，如禽流感和新城疫，出現疑似鴨坦布蘇病毒感染癥狀的時候，快速診斷是及早發現并阻斷該病毒暴發的重要手段。

本研究針對DTMUV建立的一步法RT-PCR檢測技術能特異性地擴增出718bp的序列，對BHK-21細胞毒和田間樣品均能檢出DTMUV，且僅能檢出DTMUV，對其他鴨病(I型和III型鴨肝炎病毒、鴨新城疫病毒、H5/H7/H9亞型禽流感病毒抗原、減蛋綜合征病毒、禽腺病毒)則無法檢出，說明本方法特異性良好；同一樣品多次檢測的結果都是一致的，表明重復性和穩定性良好；能檢出最低病毒含量為3.24pg/μL，表明該方法敏感性良好；在4 h之內可完成全部檢測過程；應用本研究建立的RT-PCR方法對20 份臨床可疑樣本進行檢測，檢出的陽性為10 份，其陽性率為50%，表明該方法可應用于臨床檢測。2019年，DTMUV僅在云南省部分地區零星散在發生，但是本實驗中檢出陽性率為50%，表明該病在云南省有擴大傳播范圍的趨勢。本研究建立的一步法RT-PCR方法具有靈敏、快速、穩定、特異性強的優點，對DTMUV的臨床診斷和防控具有參考價值，可為后續的流行病學調查提供技術手段。云南地區的水禽養殖戶應對該病引起重視，及時采取防控措施，避免因感染鴨坦布蘇病毒而造成經濟損失。