覆盆子抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性成分研究

劉希達，韓 娜，劉志惠，翟建秀，李嗣凱，殷 軍

覆盆子抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性成分研究

劉希達，韓 娜，劉志惠，翟建秀，李嗣凱，殷 軍*

沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016

研究華東覆盆子干燥果實中抗氧化與抑制α葡萄糖苷酶的活性成分。采用硅膠柱色譜、ODS柱色譜、凝膠柱色譜等多種色譜技術(shù)進行系統(tǒng)分離和純化，利用1H-NMR、13C-NMR波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。采用DPPH自由基清除和α葡萄糖苷酶抑制活性評價方法，評估化合物的抗氧化及α葡萄糖苷酶抑制活性。從覆盆子70%乙醇提取物的30%乙醇洗脫部位中分離得到16個化合物，分別鑒定為1,2,3,4,6-五沒食子?；?β--吡喃葡萄糖（1）、1,2,6-三沒食子?；?β--吡喃葡萄糖（2）、1-沒食子?；?β--吡喃葡萄糖（3）、原花青素B3（4）、銀鍛苷（5）、hovetrichoside C（6）、山柰酚-3--β--吡喃葡萄糖苷（7）、阿夫兒茶素-3-β--吡喃葡萄糖苷（8）、槲皮素（9）、methyl flavogallonate（10）、鞣花酸（11）、短葉蘇木酚酸甲酯（12）、2,4,6-三羥基苯乙酮-6-β--吡喃葡萄糖苷（13）、沒食子酸甲酯（14）、阿魏酸（15）、3,4′-二羥基苯乙酮（16）?；衔?0和13為首次從懸鉤子屬植物中分離得到。化合物1～4、9～12、14具有較好的抗氧化活性，化合物1、2、4、11具有較好的α葡萄糖苷酶抑制活性，化合物1的抗氧化活性與α葡萄糖苷酶抑制活性最強。

覆盆子；抗氧化活性；α-葡萄糖苷酶抑制活性；1,2,3,4,6-五沒食子酰基-β--吡喃葡萄糖；methyl flavogallonate；2,4,6-三羥基苯乙酮-6-β--吡喃葡萄糖苷

覆盆子為薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子Hu的干燥成熟果實，主要分布于我國江西、安徽、江蘇、浙江和福建，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目等功效。覆盆子的主要成分包括萜類、黃酮類、有機酸類和多糖等[1]。現(xiàn)代藥理學研究表明，覆盆子的抗氧化以及降糖活性顯著[2-3]，且與其酚類化合物有關(guān)。為了進一步闡明覆盆子抗氧化和降糖的物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組前期對覆盆子70%乙醇提取物大孔樹脂洗脫物進行了初步篩選，發(fā)現(xiàn)其30%乙醇洗脫部位具有良好活性，本研究對該部位的化學成分及生物活性進行探究，從中分離得到16個化合物，分別鑒定為1,2,3,4,6-五沒食子?；?β--吡喃葡萄糖（1,2,3,4,6-penta--galloyl-β-- glucoside，1）、1,2,6-三沒食子?；?β--吡喃葡萄糖（1,2,6-penta--galloyl-β--glucoside，2）、1-沒食子酰基-β--吡喃葡萄糖（1--glaloyl-β--glucoside，3）、原花青素B3（procyanidin B3，4）、銀鍛苷（tiliroside，5）、hovetrichoside C（6）、山柰酚-3--β--吡喃葡萄糖苷（kaempferol-3-β-- glueopyranoside，7）、阿夫兒茶素-3-β--吡喃葡萄糖苷[7-β--glucopyranosyl-(?)-afzelechin，8]、槲皮素（quercetin，9）、methyl flavogallonate（10）、鞣花酸（ellagic acid，11）、短葉蘇木酚酸甲酯（methyl brevilolin-carboxylate，12）、2,4,6-三羥基苯乙酮-6-β--吡喃葡萄糖苷（2,4,6-trihydroxy-acetophenone- 6-β--glucopyranoside，13）、沒食子酸甲酯（methyl gallate，14）、阿魏酸（ferulic acid，15）、3,4′-二羥基苯乙酮（3,4′-dihydroxypropiophenone，16）；體外活性結(jié)果顯示化合物1～4、9～12、14具有較好的抗氧化活性，化合物1、2、4、11具有較好的α葡萄糖苷酶抑制活性，化合物1的抗氧化活性與α葡萄糖苷酶抑制活性最強，為其進一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Bruker Avance-600型核磁共振波譜儀、Bruker Avance-400型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker Biospin公司）；LC-10A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Sephadex LH-20凝膠柱（美國Pharmacia公司）；柱色譜用硅膠G、GF254（100～200目，青島海洋化工廠）；色譜級甲醇（天津康科德科技有限公司）；其他試劑均為分析純（沈陽萊博試劑公司）；ODS-A液相色譜柱（50 μm，日本YMC公司）；α葡萄糖苷酶、對硝基苯基-α--吡喃葡萄糖苷（PNPG，上海麥克林生化科技有限公司）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma公司）；阿卡波糖（批號H19990205，北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；維生素C片（批號H21020713，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司）。

覆盆子購買自安國市義通中藥材有限公司，經(jīng)沈陽藥科大學中藥學院生藥學教研室殷軍教授鑒定為華東覆盆子Hu的干燥成熟果實。

2 提取與分離

取華東覆盆子干燥成熟果實6 kg，粉碎后用50 L 70%乙醇回流提取3次，2 h/次，合并提取液，減壓濃縮得7.7 L覆盆子提取物；上樣于D101型大孔吸附樹脂柱，分別用水及30%、60%、90%乙醇進行梯度洗脫，得30%乙醇洗脫部位（115.0 g）、60%乙醇洗脫部位（330.0 g）和90%乙醇洗脫部位（45.1 g）。

30%乙醇洗脫部位經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（20∶1→0∶100）梯度洗脫得到5個流分（Fr. 1～5）。Fr. 1（0.4 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（50∶1→1∶1）梯度洗脫得到5個流分（Fr. 1-1～1-5），其中亞流分Fr. 1-1經(jīng)制備液相分離，以甲醇-水（60∶40）為流動相得到化合物9（3.3 mg）。Fr. 2（0.9 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，甲醇等度洗脫得到2個流分（Fr. 2-1～2-2），F(xiàn)r. 2-1經(jīng)過反復甲醇重結(jié)晶得到化合物10（56.0 mg），F(xiàn)r. 2-2經(jīng)制備薄層色譜，醋酸乙酯-甲醇-水（5∶1∶0.9）為流動相得到化合物15（10.0 mg）。Fr. 3（6.7 g）經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇-水（30∶1∶0.1→3∶1∶0.1）梯度洗脫后得到2個流分（Fr. 3-1～3-2），F(xiàn)r. 3-1經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，甲醇等度洗脫得到化合物4（6.3 mg），F(xiàn)r. 3-2經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，甲醇等度洗脫得到2個亞流分（Fr. 3-2-1～3-2-2），F(xiàn)r. 3-2-1經(jīng)過反復甲醇重結(jié)晶得到化合物5（16.5 mg），F(xiàn)r. 3-2-2經(jīng)薄層色譜制備[醋酸乙酯-甲醇-水（5∶1∶0.9）]得到化合物6（3.1 mg）和14（2.2 mg）。Fr. 4（20 g）經(jīng)ODS柱色譜，甲醇-水（20∶80→40∶60）梯度洗脫，得到2個流分（Fr. 4-1～4-2），F(xiàn)r. 4-1經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，甲醇等度洗脫得到2個流分（Fr. 4-1-1～4-1-2），F(xiàn)r. 4-1-1經(jīng)制備液相分離純化[甲醇-水（20∶80）]得到化合物11（2.2 mg，R＝35.6 min）、13（3.0 mg，R＝42.3 min）和16（11.5 mg，R＝52.2 min），F(xiàn)r. 4-1-2經(jīng)制備液相分離純化[甲醇-水（20∶80）]得到化合物1（3.6 mg，R＝62.5 min）、2（2.1 mg，R＝46.7 min）和3（1.9 mg，R＝55.9 min），F(xiàn)r. 4-2經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，甲醇等度洗脫得到化合物12（1.4 mg）。Fr. 5（15 g）經(jīng)ODS色譜柱分離，甲醇-水（10∶90→30∶70）梯度洗脫得到5個流分（Fr. 5-1～5-5），F(xiàn)r. 5-1經(jīng)ODS色譜柱分離，甲醇-水（0∶100→30∶70）梯度洗脫得到化合物7（1.6 mg）和8（2.6 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：棕色粉末，紫外燈254 nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(600MHz, CD3OD):7.12(2H, s, 1-galloylH-2, 6), 7.06(2H, s, 2-galloylH-2′, 6′), 6.99(2H, s, 3-galloylH-2′, 6′), 6.96(2H, s, 4-galloylH-2′, 6′), 6.91(2H, s, 6-galloylH-2′, 6′), 6.24(1H, d,=8.3 Hz, H-1), 5.91(1H, t,=9.7 Hz, H-3), 5.62(2H, m, H-4), 4.51(1H, dd,=12.2, 1.9 Hz, H-5), 4.40(2H, m, H-6)；13C-NMR(150MHz, CD3OD):167.9(1-galloyl-C-7′), 167.2(2-galloyl-C-7′), 166.9(3- galloyl-C-7′), 166.9(4-galloyl-C-7′), 166.2(5-galloyl- C-7′), 146.5(1-galloyl-C-4′), 146.4(2-galloyl-C-4′), 146.4(3-galloyl-C-4′), 146.3(4-galloyl-C-4′), 146.2(5-galloyl-C-4′), 140.7(1-galloyl-C-3′, 5′), 140.3(2-galloyl-C-3′, 5′), 140.2(3-galloyl-C-3′, 5′), 140.0(4-galloyl-C-3′, 5′), 139.9(5-galloyl-C-3′, 5′), 121.0(1-galloyl-C-1′), 120.3(2-galloyl-C-1′), 120.2(3- galloyl-C-1′), 120.2(4-galloyl-C-1′), 119.7(5-galloyl- C-1′), 110.6(1-galloyl-C-2′, 6′), 110.4(2-galloyl-C-2′, 6′), 110.4(3-galloyl-C-2′, 6′), 110.3(4-galloyl-C-2′, 6′), 110.3(5-galloyl-C-2′, 6′), 93.8(GlcC-1), 74.3(GlcC-5), 74.0(GlcC-3), 72.1(Glc-C-2), 69.8(Glc-C-4), 63.1(GlcC-6)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[4]，推斷化合物1為1,2,3,4,6-五沒食子?；?β--吡喃葡萄糖。

化合物2：棕色粉末，紫外燈254 nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6): 6.96(2H, s, 1-galloylH-2, 6), 6.91(2H, s, 2-galloylH-2, 6), 6.87(2H, s, 6-galloylH-2, 6), 5.89(1H, d,=8.4 Hz, H-1), 5.03(1H, t,=9.0 Hz, H-3), 4.43(1H, d,=12.0 Hz, H-4), 4.31(1H, dd,=12.2, 4.9 Hz, H-2), 4.22(1H, t,=6.6 Hz, H-5), 3.81(2H, m, H-6)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6): 165.7(1-galloyl- C-7′), 164.9(2-galloyl-C-7′), 164.1(6-galloyl-C-7′), 145.6 (1-galloyl-C-4′), 145.5 (2-galloyl-C-4′), 145.4 (6-galloyl-C-4′), 138.6(1-galloyl-C-3′, 5′), 138.6(2- galloyl-C-3′, 5′), 138.5(6-galloyl-C-3′, 5′), 119.3(1- galloyl-C-1′), 119.1(2-galloyl-C-1′), 118.9(6-galloyl- C-1′), 108.9(1-galloyl-C-2′, 6′), 108.7(2-galloyl-C-2′, 6′), 108.6(6-galloyl-C-2′, 6′), 92.1(GlcC-1), 74.7(Glc-C-5), 73.6(GlcC-3), 72.6(GlcC-2), 69.5(GlcC-4), 65.0(GlcC-6)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[5]，推斷化合物2為1,2,6-三沒食子?；?β--吡喃葡萄糖。

化合物3：白色粉末，紫外燈254 nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(600MHz, D2O)δ: 7.18(2H, s, H-2, 6), 5.71(1H, d,=7.2Hz, GlcH-1), 3.89(1H, dd,=12.4, 1.5Hz, GlcH-3), 3.73(1H, dd,=12.5, 5.4Hz, GlcH-4), 3.61(3H, t,=7.1Hz, GlcH-6, 2), 3.48(1H, t,=9.0Hz, GlcH-5)；13CNMR(150MHz, D2O): 169.4(C-7), 147.4(C-3, 5), 142.1(C-4), 121.9(C-1), 113.2(C-2, 6), 97.2(GlcC-1), 79.7(GlcC-3), 78.3(GlcC-5), 74.9(GlcC-2), 72.0(GlcC-4), 63.2(GlcC-6)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[6]，推斷化合物3為1-沒食子?；?β--吡喃葡萄糖。

化合物4：黃色無定形粉末，紫外燈254nm下有暗斑，硅膠板薄層噴10%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6): 6.84(1H, d,=2.0Hz, H-2′), 6.77(1H, dd,=8.3, 2.1Hz,H-6′), 6.69(1H, d,=8.1Hz, H-5′), 6.60(1H, d,=2.1Hz, H-2′′′), 6.59(1H, dd,=8.2, 2.1Hz, H-6′′′), 6.57(1H, d,=8.2Hz, H-5′′′), 5.85(1H, s, H-6′′), 5.74(1H, d,=2.4Hz, H-6), 5.67(1H, d,=2.4Hz, H-8), 4.38(1H, d,=8.4Hz, H-2), 4.26(1H, d,=8.4Hz, H-2′′), 4.22(1H, m, H-3), 4.15(1H, d,=8.4Hz, H-4), 2.78(1H, dd,=16.2, 8.4Hz, H-4′′a), 2.33(1H, dd,=16.2, 8.4Hz, H-4′′b)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6): 159.5(C-9), 157.3(C-7), 154.6(C-5), 154.2(C-7′′), 153.5(C-9′′), 153.4(C-5′′), 144.8(C-3′), 144.6(C-3′′′), 144.2(C-4′′′), 144.0(C-4′), 129.1(C-1′′′), 128.9(C-1′), 118.8(C-6′), 117.6(C-6′′′), 115.3(C-5′′′), 114.9(C-2′), 114.6(C-5′), 114.3(C-2′′′), 108.4(C-8′′), 106.2(C-10), 105.8(C-10′′), 98.9(C-6)98.5(C-6′′), 95.5(C-8), 82.3(C-2), 81.4(C-2′′), 71.7(C-3), 67.0(C-3′′), 37.2(C-4), 29.0(C-4′′)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[7]，推斷化合物4為原花青素B3。

化合物5：黃色無定形粉末，紫外燈254nm下有暗斑，硅膠板薄層噴10%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6): 7.99(2H, d,=8.8Hz, H-2′, 6′), 7.37(2H, d,=8.6Hz, H-2′′, 6′′), 7.34(1H, d,=16.0Hz, H-7′′), 6.86(2H, d,=8.8Hz, H-3′, 5′), 6.79(2H, d,=8.6Hz, H-3′′, 5′′), 6.39(1H, d,=2.1Hz, H-6), 6.15(1H, d,=2.1Hz, H-8), 6.11(1H, d,=15.9Hz, H-8′′), 5.45(1H, d,=6.1 Hz, GlcH-1), 5.24(1H, d,=5.7Hz, GlcH-3), 5.18(1H, d,=4.9Hz, GlcH-4), 4.27(1H, dd,=11.9, 2.1Hz, GlcH-2), 4.03(1H, dd,=11.8, 6.3Hz, GlcH-5), 3.20(2H, m, GlcH-6)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6): 177.4 (C-4), 166.1(C-9′′), 164.2(C-7), 161.1(C-5), 160.0(C-4′), 159.8(C-4′′), 156.4(C-2), 156.3(C-9), 144.6(C-7′′), 133.0(C-3), 130.8 (C-2′, 6′), 130.1(C-2′′, 6′′), 124.9(C-1′′), 120.7(C-1′), 115.7(C-3′, 5′), 115.0(C-3′, 5′), 113.6 (C-8′′), 103.8(C-10), 100.9(GlcC-1), 98.7(C-6), 93.6(C-8), 76.2(GlcC-2), 74.2(Glc-C-5), 74.1(GlcC-3), 69.9(GlcC-4), 62.9(GlcC-6)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[8]，推斷化合物5為銀鍛苷。

化合物6：黃色無定形粉末，紫外燈254nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(400MHz, DMSO-6): 6.93(2H, t,=7.3 Hz，H-2′, 6′), 6.55(2H, d,=8.1 Hz, H-3′, 5′), 6.01(1H, s, H-5), 5.91(1H, s, H-7), 4.93(1H, d,=6.7Hz, GlcH-1), 3.65(1H, m, GlcH-3), 3.47(1H, m, GlcH-4), 3.25(4H, m, GlcH-2, 5, 6), 2.92(2H, m, H-b)；13C-NMR(100MHz, DMSO-6): 192.6 (C-3), 171.9 (C-7a),168.8 (C-6), 156.8 (C-4), 156.7 (C-4′), 131.3 (C-2′, 6′), 124.2 (C-1′), 114.7 (C-3′, 5′), 105.5 (C-2), 101.8 (C-3a), 99.4 (GlcC-1), 96.0 (C-5), 91.8 (C-7), 77.2 (Glc-C-5), 76.8 (GlcC-3), 72.9 (GlcC-2), 69.3 (GlcC-4), 60.4 (GlcC-6), 40.4 (C-b)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[9]，推斷化合物6為hovetrichosideC。

化合物7：黃色無定形粉末，紫外燈254nm下有暗斑，硅膠板薄層噴10%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6): 8.07(2H, d,=8.8Hz, H-2′, 6′), 6.86(2H, d,=8.8Hz, H-3′, 5′), 6.41(1H, d,=2.1Hz, H-8), 6.19(1H, d,=2.1Hz, H-6), 5.40(1H, d,=7.6Hz, GlcH-1), 5.19(1H, d,=4.7Hz, H-2), 4.86(1H, d,=5.7Hz, GlcH-3), 4.50(1H, d,=4.1Hz, H-3), 4.50(1H, d,=5.83Hz, GlcH-4), 3.66(1H, d,=3.5Hz, GlcH-2), 3.54(1H, ddd,=9.2, 7.5, 3.8Hz, GlcH-5), 3.47～3.44(1H, m, GlcH-6)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6): 177.9 (C-4), 165.0 (C-7), 161.6 (C-5), 160.4 (C-4′), 156.8 (C-9), 156.7 (C-2), 133.6 (C-3), 131.4 (C-2′, 6′), 121.3 (C-1′), 115.5 (C-3′, 5′), 104.2 (C-10), 102.1 (Glc, C-1), 99.2 (C-6), 94.1 (C-8), 76.2 (Glc-C-5), 73.5 (Glc-C-3), 71.6 (Glc-C-2), 68.3 (Glc-C-4), 60.6 (Glc-C-6)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[10]，推斷化合物7為山柰酚-3--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物8：黃色無定形粉末，紫外燈254nm下有暗斑，硅膠板薄層噴10%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6): 7.16(2H, d,=8.5Hz, H-2′, 6′), 6.75(2H, d,=8.5Hz, H-3′, 5′), 6.13(1H, d,=2.2Hz, H-8), 5.89(1H, d,=2.2Hz, H-6), 4.72(1H, d,=7.6Hz, GlcH-1), 4.55(1H, d,=7.9Hz, H-2), 3.84(1H, td,=8.3, 5.5Hz, H-3), 3.70～3.67(1H, m, GlcH-6a), 3.50(1H, m, GlcH-6b), 3.21(4H, dd,=15.8, 8.3Hz, GlcH-2～5), 2.93(1H, dd,=16.3, 5.5Hz, H-4), 2.40(1H, d,=8.5Hz, H-4)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6):156.9 (C-7), 156.6 (C-5), 156.3 (C-9), 155.0 (C-4′), 129.8 (C-1′), 128.6 (C-2′, 6′), 114.8 (C-3′, 5′), 101.4 (C-10), 100.6 (Glc- C-1), 96.1 (C-8), 95.0 (C-6), 81.1 (C-2), 76.9 (Glc- C-4), 76.5 (Glc-C-5), 73.2 (Glc-C-3), 69.5 (Glc-C-2), 66.1 (C-3), 60.5 (Glc-C-6), 28.0 (C-4)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[11]，推斷化合物8為阿夫兒茶素-3-β--吡喃葡萄糖苷。

化合物9：黃色無定形粉末，紫外燈254nm下有暗斑，365nm下有藍色熒光，硅膠板薄層噴10%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H-NMR(400MHz, DMSO-6): 12.48(1H, s, 5-OH), 10.76(1H, s, 3-OH), 9.57(1H, s, 7-OH), 9.34(1H, s, 4′-OH), 9.28(1H, s, 5′-OH), 7.67(1H, d,=2.2Hz, H-2′), 7.54(1H, dd,=8.5, 2.2Hz, H-6′), 6.88(1H, d,=8.5Hz, H-5′), 6.40(1H, d,=2.0Hz, H-6), 6.18(1H, d,=2.0Hz, H-8)；13CNMR(100MHz, DMSO-6): 175.8 (C-4), 163.8 (C-7), 160.7 (C-5), 156.1 (C-9), 147.6 (C-4′), 146.7 (C-3′), 145.0 (C-2), 135.7 (C-3), 121.9 (C-1′), 119.9 (C-6′), 115.5 (C-5′), 115.0 (C-2′), 103.0 (C-10), 98.1 (C-6), 93.3 (C-8)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[12]，推斷化合物9為槲皮素。

化合物10：淡黃色無定形粉末，易溶于甲醇，紫外燈254 nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6): 7.48(1H, s, H-5′), 7.09(1H, s, H-6′′), 3.44(3H, s, 7′′-OCH3)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6): 166.5 (C-7′′), 159.6 (C-7′), 157.8 (C-7), 148.2 (C-4′), 146.5 (C-4), 144.4 (C-5′′), 144.0 (C-3′′), 139.6 (C-3′), 138.6 (C-3), 137.8 (C-2′), 136.8 (C-2), 135.9 (C-4′′), 125.8 (C-1′′), 119.2 (C-6), 118.6 (C-2′′), 113.1 (C-1′), 112.0 (C-1), 110.4 (C-6), 109.6 (C-5), 107.9 (C-5′), 107.8 (C-6′′), 51.4 (-OCH3)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[13]，推斷化合物10為methylflavogallonate。

化合物11：白色無定形粉末，紫外燈254 nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6): 7.29(1H, s, H-3, 3′)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6): 160.6 (C-7, 7′), 149.4 (C-6, 6′), 139.5 (C-4, 4′), 136.4 (C-5, 5′), 113.8 (C-1, 1′), 111.0 (C-2, 2′), 108.4 (C-3, 3′)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[14]，推斷化合物11為鞣花酸。

化合物12：淡黃色針狀晶體，紫外燈254 nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6): 7.30(1H, s, H-7), 4.42(1H, dd,=7.8, 2.1Hz, H-9), 3.63(3H, s, 9b-OCH3), 2.98(1H, dd,=18.7, 7.8Hz, H-10b), 2.47(1H, dd,=18.8, 2.1Hz, H-10a)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6): 193.5 (C-11), 173.0 (C=O), 160.6 (C-8), 150.1 (C-6), 146.2 (C-2), 144.1 (C-4), 141.0 (C-5), 138.9 (C-3), 115.4 (C-7a), 113.3 (C-3a), 108.5 (C-7), 52.5 (-OCH3), 41.0 (C-9), 37.4 (C-10)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[15]，推斷化合物12為短葉蘇木酚酸甲酯。

化合物13：淡黃色針狀晶體，紫外燈254 nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6): 6.01(1H, s, H-3), 5.79(1H, s, H-5), 4.88(1H, d,=7.1Hz, GlcH-1), 3.69(1H, GlcH-3), 3.50(1H, d,=5.2Hz, GlcH-4), 3.30(2H, GlcH-2, 5), 3.21(2H, m, GlcH-6), 2.59(3H, s, H-8)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6): 201.7 (C=O), 167.6 (C-4), 166.0 (C-2), 161.1 (C-6), 103.7 (C-1), 100.6 (GlcC-1), 97.1 (C-3), 95.1 (C-5), 77.1 (GlcC-5), 76.7 (GlcC-3), 73.1 (GlcC-2), 69.4 (GlcC-4), 60.4 (GlcC-6), 32.6 (-CH3)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[16]，推斷化合物13為2,4,6-三羥基苯乙酮-6-β--吡喃葡萄糖苷。

化合物14：白色粉末，紫外燈254 nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(400MHz, DMSO-6): 6.94(2H, s, H-2, 6), 3.74(3H, s, 7-OCH3)；13C-NMR(100MHz, DMSO-6): 166.3 (C-7), 145.6 (C-3, 5), 138.4 (C-4), 119.3 (C-1), 108.5 (C-2, 6), 51.5 (-OCH3)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[17]，推斷化合物14為沒食子酸甲酯。

化合物15：無色針狀結(jié)晶，紫外燈254 nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6):7.48(1H, d,=15.9Hz, H-8), 7.27(1H, d,=2.0Hz, H-2), 7.07(1H, dd,=8.1, 2.0Hz, H-6), 6.78(1H, d,=8.1Hz, H-5), 6.36(1H, d,=15.9Hz, H-7), 3.81(3H, s, -OCH3)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6): 168.5 (C-9), 149.5 (C-3), 148.3 (C-4), 144.9 (C-7), 126.2 (C-1), 123.2 (C-6), 116.1 (C-8), 115.9 (C-5), 111.5 (C-2), 56.1 (-OCH3)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[18]，推斷化合物15為阿魏酸。

化合物16：白色無定形粉末，紫外燈254 nm下有暗斑，硅膠板薄層噴2% FeCl3乙醇溶液顯藍黑色。1H-NMR(600MHz, DMSO-6): 7.82(2H, d,=8.7Hz, H-2, 6), 6.82(2H, d,=8.8Hz, H-3, 5), 3.74(2H, t,=6.4Hz, H-8), 3.02(2H, t,=6.4Hz, H-9)；13C-NMR(150MHz, DMSO-6): 197.5 (C-7), 163.0 (C-4), 131.0 (C-2, 6), 128.7 (C-1), 115.7 (C-3,5), 57.6 (C-8), 41.3 (C-9)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[19]，推斷化合物16為3,4′-二羥基苯乙酮。

4 活性測試

4.1 化合物體外抗氧化活性的測定

覆盆子提取物及各洗脫部位用于測定的質(zhì)量濃度為15.625～500.000 μg/mL，各單體化合物用于測定的濃度為15.625～500.000 μmol/L。參照文獻方法[20]并進行適當改進，在96孔板中加入100 μL不同濃度的樣品，再加入100 μL含0.2 mmol/L DPPH的甲醇溶液；空白組加入100 μL甲醇和100 μL DPPH自由基溶液；背景組加入100 μL樣品和100 μL甲醇。避光放置20 min，測定517 nm處的吸光度（）值，按照公式計算清除率。以維生素C為陽性對照藥物，每個樣品平行測試3次。覆盆子提取物和各洗脫部位的抗氧化活性見表1，16個單體化合物的抗氧化活性見表2。

清除率＝1－(樣品－背景)/空白

表1 覆盆子提取物和各洗脫部位的抗氧化活性(, n = 3)

與維生素C組比較：**＜0.01，表2同

**< 0.01vitamin C group, same as table 2

4.2 化合物對α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

覆盆子提取物及各洗脫部位用于測定的質(zhì)量濃度為15.625～500.000 μg/mL，各單體化合物用于測定的濃度為15.625～500.000 μmol/L。參照文獻方法[21]并進行適當改進，在96孔板中加入20 μL不同濃度的樣品、20 μL PBS溶液（0.1 mol/L）和20 μL α葡萄糖苷酶（1.3 U/mL）；樣品背景組加入20 μL樣品和40 μL PBS溶液；空白組加入20 μL 2% DMSO、20 μL PBS溶液和20 μL α-葡萄糖苷酶；空白背景組加入20 μL 2% DMSO和40 μL PBS溶液；混勻后于37 ℃活化5 min，加入20 μL PNPG（2.5 mmol/L）于37 ℃反應15 min，再加入80 μL Na2CO3（0.2 mol/L）終止反應，測定405 nm處的值，按照公式計算抑制率。以阿卡波糖為陽性對照藥物，每個樣品平行測試3次。覆盆子提取物和各洗脫部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性見表3，16個單體化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性見表4。

表2 16個單體化合物的抗氧化活性(, n = 3)

表3 覆盆子提取物和各洗脫部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性(, n = 3)

與阿卡波糖組比較：**＜0.01，表4同

**< 0.01acarbose group, same as Table 4

抑制率＝1－(樣品－樣品背景)/(空白－空白背景)

5 討論

本研究從覆盆子醇提物的30%乙醇洗脫部位中分離并鑒定了16個單體化合物，包括3個鞣質(zhì)類化合物、6個黃酮類化合物、3個內(nèi)酯類化合物和4個苯酚類化合物。其中化合物10和13為首次從懸鉤子屬中分離得到。由活性數(shù)據(jù)可知，30%乙醇洗脫部位的抗氧化活性及α葡萄糖苷酶抑制活性均為最強，表明經(jīng)過不同比例的乙醇-水洗脫后，覆盆子抗氧化及抑制α葡萄糖苷酶的活性成分得到了有效富集。化合物1的清除DPPH自由基活性以及α葡萄糖苷酶抑制活性最強，其IC50分別為（2.36±1.08）、（2.41±0.11）μmol/L。本研究結(jié)果進一步豐富了覆盆子的化學物質(zhì)組成和生物學活性信息，為覆盆子的開發(fā)利用提供了研究基礎(chǔ)和依據(jù)。

表4 16個單體化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性(, n = 3)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Active components of antioxidation and αglucosidase inhibitory from

LIU Xi-da, HAN Na, LIU Zhi-hui, ZHAI Jian-xiu, LI Si-kai, YIN Jun

School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China

To investigate the active components which have antioxidant and αglucosidase inhibitory activities of dry fruits from.The fraction was separated and purified by silica gel column chromatography, ODS column chromatography, gel column chromatography. The structures of compounds were identified by1H-NMR and13C-NMR spectral data. DPPH radical scavenging and α-glucosidase inhibitory activity evaluation methods were used to assess the antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of compounds.Sixteen compounds were isolated from 30% ethanol elution site of the ethanolic extract from. The structures of these compounds were identified by spectroscopic analysis as 1,2,3,4,6-penta--galloyl-β--glucoside (1), 1,2,6-penta--galloyl-β--glucoside (2), 1--glaloyl-β--glucoside (3), procyanidin B3(4), tiliroside (5), hovetrichoside C (6), kaempferol-3-β--glueopyranoside (7), 7-β--glucopyranosyl-(?)-afzelechin (8), quercetin (9), methyl flavogallonate (10), ellagic acid (11), methyl brevilolin-carboxylate (12), 2,4,6-trihydroxy-acetophenone- 6-β--glucopyranoside (13), methyl gallate (14), ferulic acid (15), and 3,4′-dihydroxypropiophenone (16).Compounds 10 and 13 are firstly isolated from the genus. Compounds 1—4, 9—12, and 14 have good antioxidant effects, compounds 1, 2, 4, and 11 have good inhibitory activity of αglucosidase. Compound 1 has the best antioxidant activity and inhibitory activity of α-glucosidase.

Hu; antioxidant activity; αglucosidase inhibitory activity; 1,2,3,4,6-penta--galloyl-β--glucoside; methyl flavogallonate; 2,4,6-trihydroxy-acetophenone- 6-β--glucopyranoside

R284.1

A

0253 - 2670(2021)17 - 5226 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.014

2021-06-27

劉希達（1996—），男，碩士。E-mail: 441590920@qq.com

殷 軍（1965—），女，沈陽藥科大學51期中藥、1992級碩士生藥學專業(yè)及1999級博士天然藥物化學專業(yè)校友，雙博士、教授、博士生導師，遼寧省特聘教授，遼寧省百千萬人才“百人”層次，中國藥典委員會委員，遼寧省藥學會中藥與天然藥物專業(yè)委員會主任委員，曾獲全國優(yōu)秀藥師、國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技進步獎等多項獎勵。Tel: (024)43520717 E-mail: yinjun826@sina.com

[責任編輯 李亞楠]