白木烏桕中1個(gè)新的木脂素葡萄糖苷

趙海燕，王恒山，梁 東

白木烏桕中1個(gè)新的木脂素葡萄糖苷

趙海燕，王恒山，梁 東*

廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 省部共建藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004

研究白木烏桕醋酸乙酯提取物中木脂素類化學(xué)成分及其抗神經(jīng)炎癥和DPPH自由基清除活性。利用多種色譜手段（硅膠、Sephadex LH-20、ODS和制備型HPLC等）對(duì)醋酸乙酯提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，再借助現(xiàn)代波譜手段（紫外、紅外、核磁、質(zhì)譜、圓二色譜）和化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，采用脂多糖（LPS）刺激的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO模型分析化合物對(duì)NO產(chǎn)生的抑制作用，評(píng)價(jià)其潛在的抗神經(jīng)炎癥活性；另外以維生素C（Vc）作為陽(yáng)性對(duì)照分析化合物對(duì)DPPH自由基的清除能力。首次從白木烏桕醋酸乙酯提取物中分離得到2個(gè)木脂素葡萄糖苷類化合物，分別鑒定為(?)-松脂醇 4--[6--()-咖啡酰基]-β--吡喃葡萄糖苷（1）和(+)-松脂醇 4--[6--()-咖啡酰基]-β--吡喃葡萄糖苷（2）；DPPH自由基清除活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物2對(duì)DPPH自由基清除的半數(shù)抑制濃度（IC50）為38.1 μmol/L。化合物1為新化合物，命名為白木烏桕糖苷A。與陽(yáng)性對(duì)照Vc相比，化合物2對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力。

白木烏桕；木脂素葡萄糖苷；抗神經(jīng)炎癥；DPPH自由基清除能力；白木烏桕糖苷A

白木烏桕為大戟科烏桕屬植物，原拉丁名為(Sieb. et Zucc.) Pax et Hoffm.，現(xiàn)《中國(guó)植物志》將其修訂為(Siebold & Zuccarini) Esser，別名白乳木，為野生油脂植物，為灌木或喬木[1]。其在日本和朝鮮均有生長(zhǎng)，在我國(guó)主要分布在山東、安徽、江蘇、浙江、廣東、廣西等地，喜生于林中濕潤(rùn)處或溪澗邊，因?yàn)槠浔容^耐寒，部分在海拔1700 m時(shí)仍有分布[1-2]。白木烏桕具有消腫利尿的功效，常用于治療腦水腫、肺水腫等，其根葉對(duì)治療疲勞過(guò)度、腰椎疼痛、膝蓋疼痛有良好效果[3]。目前對(duì)烏桕屬植物的研究顯示該屬植物含有多種藥理活性較好的萜類、木脂素類、黃酮類、訶子酸等化學(xué)成分[4]。本課題組前期從該植物的莖葉乙醇提取物中分離得到15個(gè)黃酮糖苷和苯丙素糖苷，其中有5個(gè)黃酮糖苷顯示較好的抗神經(jīng)炎癥活性[5]。因此，為了進(jìn)一步研究白木烏桕的化學(xué)成分，從中發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物，繼續(xù)對(duì)白木烏桕莖葉的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離鑒定了2個(gè)木脂素葡萄糖苷（圖1）。并通過(guò)紫外（UV）、紅外（IR）、質(zhì)譜、核磁以及圓二色譜（ECD）等波譜手段以及酸水解實(shí)驗(yàn)確定了化合物的結(jié)構(gòu)分別為(?)-松脂醇 4--[6--()-咖啡酰基]-β--吡喃葡萄糖苷{(diào)(?)- pinoresinol 4--[6--()- caffeoyl]-β--glucopyranoside，1}和(+)-松脂醇 4--[6--()-咖啡酰基]-β--吡喃葡萄糖苷{(diào)(+)-pinoresinol 4--[6--()-caffeoyl]-β-- glucopyranoside，2}，其中化合物1為新化合物，命名為japonicoside A。采用脂多糖（LPS）刺激的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO模型分析了化合物對(duì)NO釋放的抑制效果，評(píng)價(jià)其潛在的抗神經(jīng)炎癥活性；同時(shí)分析了化合物對(duì)DPPH自由基的清除活性，發(fā)現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照維生素C（Vc）相比化合物2對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力。

圖1 化合物1和2的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Agilent 6545 Q-TOF LC-MS高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Bruker AVANCE 600 MHz核磁共振儀（Bruker BioSpin AGFacilities公司）；Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀配有SPD-M20A紫外檢測(cè)器及SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器（Shimadzu公司）；P3000高效液相色譜儀配有UV3000檢測(cè)器（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；JASCO圓二色光譜儀（JASCO公司）；柱色譜硅膠（200～300目）及薄層色譜硅膠GF254購(gòu)自青島海洋化工廠；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20購(gòu)自瑞典 Pharmacia Biotech公司；反相柱色譜硅膠RP18（50 μm）、YMC ODS C18色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm）和小孔樹脂（MCI）CHP20（75～150 μm）分別購(gòu)自日本的YMC公司和Mitsubishi公司；色譜純?cè)噭┵?gòu)自美國(guó)Tedia和Fisher公司；分析純?cè)噭┵?gòu)自西隴化工股份有限公司。

樣品于2019年4月采集于廣西桂林，由廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院唐紹清教授鑒定為白木烏桕(Siebold & Zuccarini) Esser，標(biāo)本（NJ-201904）保存于廣西師范大學(xué)西南民族藥協(xié)同創(chuàng)新中心。

2 提取與分離

白木烏桕干燥莖葉（20.5 kg）清除凈雜質(zhì)后，用90%乙醇70 ℃加熱回流提取4次（100 L/次），每次3 h。將4次提取液合并后減壓濃縮得到乙醇總浸膏（2.5 kg）。將以上浸膏加水混溶，再依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇分別萃取，得到石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4個(gè)部位。

取醋酸乙酯萃取部位（1.1 kg）過(guò)大孔樹脂柱，以30%、50%、80%、95%乙醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)組分NJ. A～D。取NJ. C（121.0 g）過(guò)MCI柱，以30%～100%甲醇作為流動(dòng)相，得到共7個(gè)組分NJ. C. M1～C. M7。

將組分NJ. C. M6（20.8 g）過(guò)硅膠（200～300目）柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（100∶1～1∶1）作為流動(dòng)相，得到NJ. C. M6. G1～C. M6. G6。

將組分NJ. C. M6. G5（353.2 mg）過(guò)ODS柱，以30%～100%甲醇作為流動(dòng)相，共得到7個(gè)組分NJ. C. M6. G5. O1～M6. G5. O7。

將組分NJ. C. M6. G5. O2（25.0 mg）經(jīng)半制備HPLC分離（乙腈-水23∶77，6 mL/min），得到化合物2（4.2 mg，R＝69.0 min）和1（2.1 mg，R＝73.6 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1和2的氫譜和碳譜數(shù)據(jù) (600/150 MHz, MeOH-d4)

進(jìn)一步分析該化合物的2D-NMR數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)H-1?/H-2?、H-2?/H-3?、H-3?/H-4?、H-4?/H-5?、H-5?/H2-6?的1H-1H COSY相關(guān)信號(hào)（圖2），結(jié)合1組較大的偶合常數(shù)31?, 2?(7.8 Hz)、32?, 3?(9.0 Hz)、33?, 4?(9.0 Hz)、34?, 5?(9.0 Hz) 可以確定12個(gè)脂肪碳中的6個(gè)為β-葡萄糖片段（a）的碳信號(hào)。隨后分析化合物1的HMBC譜，首先可以得到除糖片段以外的如圖2所示的b、c、d 這3組C6-C3結(jié)構(gòu)片段。其次根據(jù)H2-6?/C-9?′、H-1?/C-4這2個(gè)關(guān)鍵的HMBC相關(guān)信號(hào)，可以確定a、b、d存在如圖所示的連接方式。最后根據(jù)H-8/8′的1H-1H COSY相關(guān)，以及H2-9′/C-7、H2-9/C-7′的HMBC相關(guān)，結(jié)合分子式可以確定結(jié)構(gòu)片段b和c之間是通過(guò)7--9′和9--7′連接的，從而確定了化合物的平面結(jié)構(gòu)。

圖2 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY、HMBC和NOESY相關(guān)

通過(guò)與類似化合物H-7/H-7′、H-8/H-8′、C-8/C-8′的核磁數(shù)據(jù)，以及37, 8和37′, 8′的偶合常數(shù)對(duì)比，推測(cè)此化合物木脂素片段的相對(duì)構(gòu)型與pinoresinol和化合物2相同[6-7]。取化合物1.0 mg，加入8%的鹽酸1 mL，在80 ℃條件下水解6 h，水解液用醋酸乙酯萃取得到苷元和連有咖啡酰基的葡萄糖片段，連有咖啡酰基片段的糖部分的旋光為正值，從而確定化合物中的糖為β--葡萄糖[5,8]。同時(shí)測(cè)定了水解后化合物1和2苷元的ECD曲線（圖3），從圖中可知在238 nm處為正值（＋5.07），277 nm處為負(fù)值（?3.19），從而確定其絕對(duì)構(gòu)型為7, 7′, 8, 8′1[6]。最后結(jié)合化合物1及水解后得到苷元的負(fù)旋光值將其鑒定為(?)-松脂醇 4--[6--()-咖啡酰基]-β--吡喃葡萄糖苷，并命名為japonicoside A。

圖3 化合物1和2苷元的ECD譜圖

4 生物活性研究

4.1 對(duì)NO產(chǎn)生的抑制活性

LPS可以刺激BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO、促炎細(xì)胞因子和活性氧等[9]。本實(shí)驗(yàn)采用Griess法檢測(cè)化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO的影響[10]，并用MTT法檢測(cè)化合物對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與陽(yáng)性對(duì)照米諾環(huán)素（IC50＝15.6 μmol/L）相比，化合物1和2對(duì)NO釋放的抑制作用均不明顯，IC50值大于50 μmol/L。

4.2 DPPH自由基清除活性

DPPH作為一種人工合成的商業(yè)自由基被廣泛用在抗氧化分析模型中，本實(shí)驗(yàn)在評(píng)價(jià)化合物對(duì)DPPH自由基清除能力時(shí)以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照[12-13]。結(jié)果表明在相同的測(cè)試條件下，當(dāng)Vc對(duì)DPPH自由基清除率IC50為20.7 μmol/L時(shí)，化合物2對(duì)DPPH自由基有相對(duì)較好的清除活性（IC50＝38.1 μmol/L），而化合物1對(duì)DPPH自由基的清除能力較弱（IC50＞100 μmol/L）。初步推測(cè)此類化合物中7, 7′, 8, 8′2構(gòu)型較7, 7′, 8, 8′1構(gòu)型的分子空間排列更容易與自由基的孤對(duì)電子配對(duì)，從而影響其對(duì)自由基的清除活性。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)白木烏桕中的木脂素類化合物進(jìn)行了研究，得到的2個(gè)木脂素糖苷都是首次從該植物中發(fā)現(xiàn)，其中化合物1是新化合物。在對(duì)2個(gè)化合物的生物活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雖然化合物1和2沒有明顯的抗神經(jīng)炎癥活性，但是化合物2對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力。本研究不但豐富了白木烏桕的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類型，而且對(duì)其進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志 [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1997: 21.

[2] 張克迪. 山桏、白木烏桕育苗、嫁接試驗(yàn)初報(bào) [J]. 浙江林業(yè)科技, 1981, 1(4): 162-164.

[3] Lai X Z, Yang Y B, Shan X L. The investigation of euphorbiaceous medicinal plants in Southern China [J]., 2004, 58(S1): S307-S320.

[4] Al Muqarrabun L M, Ahmat N, Aris S R. A review of the medicinal uses, phytochemistry and pharmacology of the genus[J]., 2014, 155(1): 9-20.

[5] Zhao H Y, Wang Y Q, Li Y C,. Flavonol glycosides and phenylpropanoid glycosides with inhibitory effects on microglial nitric oxide production from[J]., 2021, 151: 104877.

[6] Xiong L, Zhu C G, Li Y R,. Lignans and neolignans fromand their absolute configurations [J]., 2011, 74(5): 1188-1200.

[7] Nagatani Y, Warashina T, Noro T. Studies on the constituents from the aerial part ofDC. II [J]., 2002, 50(5): 583-589.

[8] Zhang L, Gao H Y, Baba M,. Extracts and compounds with anti-diabetic complications and anti-cancer activity fromBlume (Chinese chestnut) [J]., 2014, 14: 422.

[9] Bi X L, Yang J Y, Dong Y X,. Resveratrol inhibits nitric oxide and TNF-alpha production by lipopolysaccharide-activated microglia [J]., 2005, 5(1): 185-193.

[10] Zhang Y L, Pan Q M, Liao H B,. Coumarinolignoids and lignanoids from the stems and leaves of[J]., 2019, 133: 17-22.

[11] Li J, Li N, Li X,. Characteristic?acid derivatives fromwith antineuroinflammatory activities [J]., 2017, 80(12): 3081-3092.

[12] Zhang Z S, Wang X M, Zhang J J,. Potential antioxidant activitiesof polysaccharides extracted from ginger () [J]., 2011, 86(2): 448-452.

[13] Yang Z N, Su B J, Wang Y Q,. Isolation, absolute configuration, and biological activities of chebulic acid and brevifolincarboxylic acid derivatives from[J]., 2020, 83(4): 985-995.

One new lignan glucoside from

ZHAO Hai-yan, WANG Heng-shan, LIANG Dong

State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources, School of Chemistry and Pharmaceutical Sciences, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China

To study the chemical constituents from the EtOAc extract ofand their anti-neuroinflammatory and DPPH-radical scavenging activity.The chemical constituents were isolated and purified by silica gel, Sephadex LH-20, ODS column chromatographies, and semi-preparative HPLC, then their structures were elucidated by extensive modern spectroscopic analyses (UV, IR, NMR, HRESIMS, and ECD) and chemical methods. All compounds were evaluated for their anti-neuroinflammatory activities by inhibiting the nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated murine BV-2 microglial cells and their DPPH-radical scavenging abilities with the positive control vitamin C.Two lignan glucosides were isolated from the EtOAc extract ofand identified as (?)-pinoresinol 4--[6--()-caffeoyl]-β--glucopyranoside (1) and (+)-pinoresinol 4--[6--()-caffeoyl]-β--glucopyranoside (2). The results of DPPH-radical scavenging activity showed that the IC50value of compound 2 was 38.1 μmol/L.Compound 1 is a new lignan glucoside named as japonicoside A. Compound 2 exhibited moderate DPPH-radical scavenging activity, compared to the positive control Vc (IC50= 20.7 μmol/L).

(Siebold & Zuccarini) Esser; lignan glucosides; anti-neuroinflammation; DPPH-radical scavenging ability; japonicoside A

R284.1

A

0253 - 2670(2021)17 - 5198 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.010

2021-07-21

廣西八桂青年學(xué)者項(xiàng)目；廣西自然科學(xué)基金杰出青年項(xiàng)目（2017GXNSFFA198004）

趙海燕（1985—），女，博士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail: 525032442@qq.com

梁 東（1983—），男，沈陽(yáng)藥科大學(xué)2006級(jí)碩士天然藥物化學(xué)專業(yè)校友，教授、廣西師范大學(xué)藥用資源化學(xué)與藥物分子工程省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任助理、廣西第一批八桂青年學(xué)者、廣西自然科學(xué)杰出青年基金獲得者，主要從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: liangdonggxnu@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]