氟化共價有機聚合物固相微萃取-高效液相色譜測定水產品中丁香酚類麻醉劑

王興益, 陳彥龍, 李攻科

(1. 中山大學化學學院, 廣東 廣州 510275; 2. 興義民族師范學院生物與化學學院, 貴州 興義 562400)

丁香酚作為一種漁用麻醉劑,在水產品長途運輸中,可降低呼吸和代謝強度,減少碰撞,降低其死亡率而被廣泛使用[1]。但有研究表明,高劑量的丁香酚會引起心律失常、腎臟損傷、消化系統等問題,對人類健康造成潛在危害[2],因此日本食品安全法規定丁香酚在水產品體內的最大殘留量為50 μg/kg[3],但我國還未對其使用和殘留量制定相關法規,針對其在水產品中的痕量殘留檢測的文獻報道較少。目前,丁香酚類麻醉劑常用的檢測方法有氣相色譜-質譜(GC-MS)[4-7]、高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)[8]、高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)[9,10]和電化學(EC)[11]等,但水產品中丁香酚類麻醉劑含量少,基質復雜,對其進行準確檢測存在一定困難。高效的樣品前處理方法是獲得準確結果的有效方法,現有液液萃取(LLE)[9]、固相萃取(SPE)[4]、分散固相萃取(DSPE)[8]和固相微萃取(SPME)[7,12]等方法應用在水產品前處理中,其中LLE方法操作簡單,但很難消除水產品中色素、脂肪和蛋白質等雜質對測定的干擾,DSPE方法在處理過程中容易造成目標物損失導致回收率偏低,所以SPE和SPME技術在水產品前處理中更為常用,特別是針對水產品中一些揮發性和痕量物質檢測時,SPME技術因其高效低耗、綠色環保顯示出更大的優勢而被廣泛使用[13]。

SPME涂層是決定方法選擇性、靈敏度、壽命、重現性和應用價值的關鍵。SPME涂層的種類有限,其萃取容量或選擇性難以滿足不同性質復雜樣品的痕量分析要求,亟待發展新型SPME涂層[14]。氟化共價有機聚合物(fluorinated covalent organic polymer, F-COP)是一類具有拓撲結構的新型多孔聚合材料,主要由輕質原子通過較強的共價鍵相互連接而成,具有物理化學性質穩定、吸附容量高、孔結構和尺寸可控等特點,而且F-COP結構中含有氟官能團,可以與酚羥基之間形成氫鍵相互作用,從而實現對目標物的特異性識別與吸附,因此F-COP吸附劑在丁香酚類化合物的富集與分析中有很大的應用潛力[15-17]。

本文以三氟甲磺酸鈧為催化劑,在室溫下合成一種F-COP材料,并采用黏合法在石英棒表面制備SPME涂層,結合HPLC-UV建立了測定丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚的分析方法,并將該方法成功應用到羅非魚和基圍蝦的分析中,為水產品中丁香酚類麻醉劑的殘留檢測提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

LC-2010島津液相色譜儀(日本島津); H1850臺式高速離心機(湖南湘儀); DZF-6020真空干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司); GZX-9146鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠); DF-101S恒溫加熱攪拌器(鞏義予華儀器有限責任公司); KQ-300DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); Nicolet Magna 750傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet); Gemini SEM 500場發射掃描電子顯微鏡(德國Zeiss); D8 Advance X射線衍射儀(德國Bruker); ASAP 2020全自動氣體吸附儀(美國Micromeritics)。

2,3,5,6-四氟對二苯甲醛(TFA, 純度98%)、1,3,5-三(4-氨苯基)苯(TAPB, 純度97%)、三氟甲磺酸鈧(Sc(OTf)3, 純度99%)(畢得醫藥);丁香酚(純度98%)、乙酸丁香酚酯(純度98%)、甲基丁香酚(純度98%)的標準品、1,4-二氧六環(無水級,純度99.5%)(北京百靈網科技有限公司); 1,3,5-三甲苯(無水級,純度97%)(阿拉丁試劑(上海)有限公司);聚丙烯腈(PAN,平均相對分子質量150 000)(分析純,美國Sigma-Aldrich公司);N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、氫氧化鈉、鹽酸、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃(分析純,天津市大茂化學試劑廠);甲醇、乙醇、乙腈和丙酮(色譜純,Dikma公司);石英棒(外徑920 μm,純度99.99%)(富友石英制品廠);實驗中所用超純水均為Milli-Q制備。

1.2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil Plus C18-B(250 mm×4.6 mm, 5 μm);紫外檢測波長:280 nm;流動相:甲醇-水(60∶40, v/v);流速:0.800 mL/min;進樣量:20.0 μL;柱溫:30 ℃。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取10.0 mg(精確至0.2 mg)丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚標準品,用色譜純甲醇配制成400 mg/L的混合標準儲備液,于4 ℃下冷藏保存備用。實驗所需不同濃度溶液均用超純水進行稀釋。

1.4 F-COP-SPME石英棒的制備

1.4.1F-COP材料的制備

根據文獻[18,19]報道的合成方法并進行適當修改,制備F-COP材料。具體合成方法如下:稱取TAPB (36 mg)和TFA (31 mg),加入4 mL的1,4-二氧六環-1,3,5-三甲苯(4∶1, v/v)混合溶液,超聲至完全溶解。在超聲條件下緩慢加入2 mg Sc(OTf)3催化劑,室溫下密封靜置反應10 min,得到黃色固體物質,分別用1,4-二氧六環和甲醇超聲洗滌3次(3×10 mL),然后離心分離,獲得的材料在60 ℃真空條件下干燥12 h備用。

1.4.2F-COP-SPME石英棒的制備

截取5 cm石英棒,依次用1 mol/L氫氧化鈉和1 mol/L鹽酸溶液各浸泡5 h,再用超純水超聲清洗后于100 ℃下烘干備用。采用黏合法制備F-COP-SPME石英棒,具體過程如下[12]: (a)分別稱取90 mg F-COP粉末和90 mg PAN粉末于3 mL玻璃小瓶中,加入1.5 mL DMF,放入小磁子攪拌,超聲分散形成均勻漿液;(b)將石英棒插入漿液中,再從漿液中緩慢拉出,置于空氣中晾干1 min,再放入80 ℃烘箱中加熱30 min,重復此操作2次;(c)將涂覆后的石英棒放入150 ℃烘箱中老化2 h; (d)老化后的石英棒涂層分別用10 mL丙酮、甲醇和超純水各超聲清洗10 min; (e)用刀片小心刮去多余涂層,保留涂層的長度為2.0 cm,最終得到SPME石英棒。F-COP-SPME石英棒每次使用前用10 mL甲醇和10 mL超純水各清洗10 min后再進行萃取。

1.5 樣品前處理

鮮活羅非魚和基圍蝦購于廣州當地水產品市場,將其洗凈去除魚鱗、蝦皮和內臟,然后用組織勻漿機絞碎樣品,放入-20 ℃下保存待分析。稱取2.00 g樣品放入50 mL離心管中,加入5 mL乙腈和5.00 g硫酸鈉后,依次渦旋振蕩和超聲各10 min,再以5 000 r/min速度離心10 min,移取上層清液至另一支離心管中,殘渣按上述步驟重復提取一次,合并兩次上清液,加入5 mL正己烷脫脂,渦旋振蕩10 min,靜置10 min,去除上層正己烷相,將剩余溶液在室溫下氮氣吹干,加3.00 mL超純水重溶,得到樣品溶液。

1.6 F-COP-SPME萃取過程

將3.00 mL樣品溶液置于4 mL帶密封墊的樣品瓶中,插入制備的F-COP-SPME石英棒,涂層需全部侵入樣品溶液中,室溫下攪拌萃取(700 r/min) 30 min。然后將石英棒立即放入加有500 μL乙腈解吸液的小瓶中,超聲解吸10 min,解吸液經0.45 μm濾膜過濾后待HPLC-UV分析。F-COP-SPME石英棒每次使用后,用10 mL甲醇和10 mL超純水各清洗3次后待下次使用。

1.7 模擬計算

通過Gaussian 09和Discovery Studio軟件,在密度泛函理論方法優化結構的基礎上,計算丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚與所制備F-COP材料間的吸附能和電子云分布情況[20]。

2 結果與討論

2.1 F-COP-SPME石英棒的設計與制備

SPME涂層的制備方法主要有:物理沉積法[17]、溶膠-凝膠法[21]、化學鍵合法[22]、電化學法[23]、原位生長[24]和黏合法[12,25]等。其中,黏合法具有更好的通用性,適用于制備不同類型材料的SPME涂層。PAN作為一種黏合劑,除具有較好的生物相容性外,還有較高的化學和機械穩定性,適用于生物樣品中活性物質的SPME[12,25]。F-COP結構中的F可以與丁香酚中的-OH基團形成氫鍵相互作用,所以F-COP對丁香酚類化合物具有特異性吸附作用。因此,本文以F-COP為吸附材料,以PAN為黏合劑制備了性能良好的F-COP-SPME石英棒,并將該石英棒用于水產品中丁香酚類麻醉劑的分析檢測。制備及其應用過程見圖1。

圖1 氟化共價有機聚合物固相微石英棒的制備及其應用Fig. 1 Preparation and application of the F-COP-SPME bar TAPB: 1,3,5-tris(4-aminophenyl)benzene; TFA: 2,3,5,6-tetrafluoroterephthalaldehyde; Sc(OTf)3: scandium (Ⅲ) triflate; F-COP: fluorinated covalent organic polymer.

2.2 F-COP-SPME石英棒結構性能表征

通過傅里葉紅外光譜(見圖2a)來確定F-COP的特征官能團。從F-COP曲線可以看出,在1 601 cm-1處存在較強吸收峰,為席夫堿反應生成的F-COP骨架中C=N的特征伸縮振動峰[26],從TAPB曲線中能找到N-H(3 433、3 351、3 209 cm-1)和C-N (1 279 cm-1)的伸縮振動峰;從TFA曲線中很明顯地看到1 704 cm-1的C=O的特征吸收峰,1 485 cm-1的C-C和1 297 cm-1的C-F伸展振動峰。這些結果表明通過TAPB與TFA的縮合反應成功合成了F-COP材料。

通過X射線衍射方法探究了F-COP的晶型結構。從圖2b可以看出,F-COP的X射線衍射圖中有一個寬反射峰,說明合成的F-COP是非晶態聚合物。

F-COP材料的N2吸附-解吸等溫線如圖2c所示,根據IUPAC的分類標準,屬于典型的Ⅳ型,表明F-COP具有介孔特性,在低壓段N2吸附量很快上升至較高值,說明材料中還存在微孔結構,這與孔徑分布曲線(如圖2c的內插圖)顯示的F-COP材料的平均孔徑為3.69 nm的結果相一致。采用非局部密度泛函理論計算得到F-COP材料的比表面積和孔體積分別為35 m2/g和0.12 cm3/g。

圖2 (a) F-COP、TAPB和TFA的傅里葉紅外光譜圖, (b) F-COP的X射線衍射圖, (c) F-COP的N2吸附-解吸等溫線和孔徑分布圖, (d-f) F-COP-SPME石英棒的掃描電鏡圖Fig. 2 (a) Fourier transform infrared spectra of the F-COP, TAPB, and TFA, (b) X-ray diffraction pattern of theF-COP, (c) N2 adsorption-desorption isotherms and pore size distribution of the F-COP, and (d-f) scanning electron micrographs of the F-COP-SPME barMagnifications: d. 90×; e. 110×; f. 1500×.

通過掃描電鏡對F-COP-SPME石英棒表面形貌進行表征。如圖2d可見,石英棒表面粗糙、多孔,這種結構能增加涂層與樣品之間的接觸面積,提高樣品的萃取容量。此外,從F-COP-SPME石英棒的橫截面(圖2e和f)看出,涂層緊密地涂覆在石英表面上,厚度約為50 μm,說明制備的石英棒牢固,可以多次重復使用。

2.3 F-COP-SPME石英棒的重現性和穩定性

分別取同一批次和不同批次制備的F-COP-SPME石英棒,對50 μg/L的混合標準溶液(丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚)重復萃取5次,考察石英棒萃取性能的重現性。實驗結果顯示,同一批次和不同批次制備的F-COP-SPME石英棒之間,丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚峰面積的相對標準偏差(RSD)分別小于6.3%和8.7%,表明自制F-COP-SPME石英棒具有較好的制備重現性。

將F-COP-SPME石英棒分別浸泡于水、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯和四氫呋喃中超過24 h,均未發現涂層有溶脹和開裂的現象,表明涂層的溶劑耐受性良好。

用同一根F-COP-SPME石英棒對50 μg/L丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚的混合標準溶液重復萃取10次,萃取峰面積的RSD小于4.8%,且涂層也沒有明顯的溶脹和脫落現象,表明自制F-COP-SPME石英棒的穩定性較好。

2.4 萃取條件優化

將制備的F-COP-SPME石英棒用于丁香酚類麻醉劑的萃取,考察石英棒的萃取性能。為獲得最佳的萃取量,對影響萃取量的幾個重要條件(萃取時間、攪拌速度、解吸溶劑及解吸時間)進行了優化。實驗過程中,以萃取體積為3.00 mL,質量濃度為500 μg/L的目標物混合標準溶液考察優化條件,結果見圖3。

2.4.1萃取時間

SPME是一個平衡吸附過程,萃取量與萃取時間有著密切關系。實驗考察了萃取時間(5～60 min)對SPME萃取量的影響。從圖3a中可以看出,隨著萃取時間的延長,3種麻醉劑的萃取量在30 min時基本達到了吸附平衡。隨著萃取時間的進一步增加,萃取量沒有明顯增加。因此,為了提高樣品前處理效率,選擇30 min作為萃取時間。

2.4.2攪拌速度

攪拌可以加速分析物從樣品溶液向F-COP-SPME石英棒的擴散,縮短吸附平衡時間。實驗中考察了不同攪拌速度下3種麻醉劑的萃取量(圖3b)。實驗發現,當攪拌速度達到700 r/min時,萃取率最大。繼續增加攪拌速度,萃取率變化不明顯,逐漸趨于平緩。所以,SPME萃取中選擇攪拌速度為700 r/min。

2.4.3解吸溶劑

解吸溶劑的選擇對解吸量有很大影響,良好的解吸溶劑可以最大限度地將目標物從石英棒上洗脫下來。實驗中,選擇了常見的甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯溶劑作為解吸溶劑進行研究。結果如圖3c所示,在相同的萃取和洗脫條件下,乙腈的解吸效果最好。因此,選擇乙腈為最佳解吸溶劑。

2.4.4解吸時間

為了實現3種麻醉劑最大程度的洗脫,實驗考察了不同時間段中解吸量的變化,結果如圖3d所示,3種麻醉劑的洗脫量在10 min基本達到最大值。因此,選擇10 min為解吸時間。

2.5 吸附機理

F-COP具有富苯環和共軛雙鍵的高交聯結構,可以與丁香酚類化合物分子形成π-π堆疊作用。此外,采用分子模擬計算(Gaussian 09),探究了F-COP與丁香酚類化合物分子之間的吸附機理[17,27]。F-COP結構中的-F可以與丁香酚類化合物之間形成F…O-H氫鍵,提高目標分子的吸附能力,F-COP的這些特性使其成為優良的SPME介質。分子模擬發現,丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚均穩定地存在于F-COP空腔結構中(見圖4)。從圖4a可知,丁香酚可以與F-COP骨架結構中的N和F形成氫鍵,氫鍵鍵長分別為0.191和0.232 nm,兩種氫鍵的共同作用,使得F-COP與丁香酚之間有較強的吸附,其吸附能為49.9 kJ/mol。相比于丁香酚,F-COP與乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚之間不存在氫鍵相互作用,因此吸附較弱,其吸附能分別為17.9和19.4 kJ/mol。在此基礎上,利用Discovery Studio軟件模擬計算了F-COP與丁香酚類化合物分子之間的電子云分布。從圖4d和f可知,F-COP與丁香酚和甲基丁香酚之間存在電荷轉移,因此主客體分子間吸附較強。從圖4e可知,F-COP與乙酸丁香酚酯之間幾乎不存在電荷轉移,因此主客體分子間吸附較弱。上述的模擬計算結果與實驗結果吻合,即F-COP與丁香酚之間識別能力最高,甲基丁香酚次之,乙酸丁香酚酯最弱。

圖4 F-COP與目標分子間吸附能力及電子云分布理論模擬圖Fig. 4 Theoretical simulation of the adsorption ability and electron cloud distribution of the F-COP toward objectsa,d. eugenol; b,e. eugenyl acetate; c,f. methyl eugenol.

2.6 方法的驗證

在優化的萃取條件下,探究了3種丁香酚類麻醉劑的線性關系、線性范圍、相關系數(r2)及檢出限(LOD)等性能參數。結果如表1所示,丁香酚和乙酸丁香酚酯在10～1 000 μg/L,甲基丁香酚在10～1 500 μg/L范圍內具有良好的線性關系,r2大于0.996 1。3種丁香酚類麻醉劑的LOD(S/N=3)在2.9～4.5 μg/kg之間,該法的檢出限可以滿足日本和歐盟等國家對丁香酚類麻醉劑在水產品體內殘留最高限量為50 μg/kg的檢測要求。

表1 F-COP-SPME-HPLC-UV檢測3種丁香酚類麻醉劑的方法性能參數

與文獻報道的水產品中丁香酚類麻醉劑的檢測方法相比,本研究建立的方法的檢出限較低,可以滿足水產品中丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚3種麻醉劑殘留的同時檢測。幾種方法的線性范圍和檢出限見表2。

表2 本方法與文獻報道的水產品中丁香酚類麻醉劑檢測方法比較

2.7 實際樣品分析及加標回收率試驗

采用所建立的F-COP-SPME-HPLC-UV方法對羅非魚和基圍蝦樣品進行分析檢測,在羅非魚樣品中檢測出丁香酚含量為101 μg/kg,超出了日本和歐盟等國家對丁香酚類麻醉劑在水產品體內殘留限量為50 μg/kg的標準。實際樣品的相關譜圖見圖5。

圖5 羅非魚和基圍蝦樣品的HPLC-UV圖Fig. 5 HPLC-UV chromatograms of tilapia and shrimp samples a. direct injection of sample solution; b. sample solution extracted by the F-COP-SPME bar; c. spiked sample solution (100 μg/kg) extracted by the F-COP-SPME bar.

采用在實際樣品中加標驗證方法的可靠性,加標水平分別為50和100 μg/kg。3種麻醉劑在兩種樣品中的加標回收率分別為76.7%～98.7%和80.3%～104%, RSD分別為8.5%～11.8%和8.6%～12.4%(見表3),表明所建立方法具有良好的精密度和準確度,可以滿足實際水產品中丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚類麻醉劑殘留的分析要求。

表 3 3種丁香酚類麻醉劑在水產品中的加標回收率及RSD(n=5)

3 結論

本研究制備了新型氟化共價有機聚合物,將其作為SPME石英棒涂層吸附劑,制備了F-COP-SPME石英棒,結合HPLC-UV建立了測定丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚的分析方法,并將該方法成功地應用到水產品中丁香酚類麻醉劑的殘留檢測中,方法操作簡單,線性范圍寬,檢出限低,適用于水產品中丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚3種麻醉劑殘留的同時分析。