基于高效液相色譜定量指紋圖譜和液相色譜-質譜聯用定量的酸棗仁提取物質量考察

郭秀潔, 李昊虬, 馮昊天, 戚華文, 張 露,徐 偉, 伍言娟, 王超然*, 梁鑫淼

(1. 中國科學院大連化學物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2. 中科院大化所中國醫藥城生物醫藥創新研究院, 江蘇 泰州 225300; 3. 內蒙古乳業技術研究院有限責任公司, 內蒙古 呼和浩特 010110; 4. 內蒙古伊利實業集團股份有限公司, 內蒙古 呼和浩特 010110)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子,具有養心補肝,寧心安神等功效[1,2],是我國最著名的安神類中藥材之一,也是衛生部頒布的第一批藥食同源中藥材,被廣泛應用于“棗仁安神顆粒”、“百樂眠膠囊”和“太太靜心口服液”等中成藥或保健品[3,4]。酸棗仁的主要活性成分為以斯皮諾素為代表的黃酮類和以酸棗仁皂苷A和B為代表的皂苷類等。研究表明,這些活性成分不僅具有鎮靜催眠作用,還具有神經元保護作用,可抗焦慮、抗抑郁、改善記憶和治療老年癡呆等[5-7]。隨著現代社會工作節奏的加快,生活壓力的增加,患有睡眠障礙問題的人群越來越多,酸棗仁水提物作為一種有效的助眠原料也正被日益廣泛地應用到各類助眠產品的開發中,獲得了極大的關注。然而,當前市場上酸棗仁提取物缺少統一標準,市場產品良莠不齊,存在理棗仁摻假、輔料稀釋增重或采用醇提等不合規生產工藝提高成分含量等一系列問題,導致企業在應用酸棗仁提取物開發功能性食品時,難以評估供應商原料的真假優劣,面臨較大的質量風險。為此,企業亟須建立一種準確、全面的分析方法對酸棗仁提取物進行質量評價。

2020版《中國藥典》對酸棗仁藥材分別采用兩個液相色譜方法對斯皮諾素和酸棗仁皂苷A進行含量測定,其中酸棗仁皂苷A的含量測定使用蒸發光散射檢測器(ELSD)檢測。斯皮諾素在摻假品理棗仁中含量更高,而酸棗仁皂苷A在理棗仁中幾乎沒有,酸棗仁皂苷B在酸棗仁中的含量也遠高于理棗仁,因此兩個皂苷成分可以作為兩者區分的特征成分[8,9]。目前,針對酸棗仁提取物含量測定的文獻報道較少,且多針對醇提物中酸棗仁皂苷A和B的測定[10],或者是采用樹脂富集后進行總皂苷測定[11]。但由于酸棗仁皂苷本身含量較低(飲片要求含量不低于0.03%),水提過程中皂苷轉移率低,且在生產過程中往往添加輔料輔助干燥或進行稀釋,針對藥材或醇提工藝開發的HPLC-ELSD含量測定方法靈敏度不足以適用于提取物的檢測。為此,本文建立了超高效液相色譜-三重四極桿質譜(UPLC-QqQ-MS/MS)法來測定酸棗仁水提物中皂苷A、B含量,同時采用定量指紋圖譜的方法,建立了斯皮諾素的含量測定及其他7種成分的峰面積半定量對比方法,最終將這10種成分的含量差異統一用雷達圖形象展示,對不同廠家的酸棗仁提取物進行比較研究,為酸棗仁提取物的內控質量標準建設和供應商篩選提供更多依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Alliance高效液相色譜系統,包括2695梯度泵、2998二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱恒溫系統和Empower色譜工作站;島津超高效液相色譜(UHPLC)系統,配SPD-20A紫外檢測器,與AB SCIEX X500系列四極桿飛行時間(QTOF)質譜儀聯用;Waters I-Class Xevo TQ-XS超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀;MS204TS電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)。

斯皮諾素對照品(批號DST191025-060,規格20 mg,含量92.7%)、酸棗仁皂苷A對照品(批號DST200510-058,規格20 mg,含量91.7%)和酸棗仁皂苷B對照品(批號DST210412-059,規格20 mg,含量87.2%)購自成都德思特生物技術有限公司。3批酸棗仁飲片分別購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司、北京宏濟藥業有限公司和盛實百草藥業有限公司,并經中國科學院大連化學物理研究所楊小平高級工程師鑒定為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子。

酸棗仁提取物為自制或購自不同廠家,具體信息見表1。乙腈(色譜級)、甲醇(色譜級)均購自Sigma-Aldrich。磷酸(色譜級)、甲酸(色譜級)購自Aladdin。實驗室用水來自美國Milli-Q超純水凈化系統。

表1 酸棗仁提取物樣品信息

1.2 樣品制備

1.2.1酸棗仁水提物

稱取40 g酸棗仁飲片至圓底燒瓶,加水400mL,浸泡30 min,回流提取1 h,濾過,濾液轉移至1 000 mL容量瓶中,濾渣加400 mL水二次回流提取1 h,濾過,濾液轉移至前述容量瓶中,冷卻至室溫后定容,搖勻,取500 mL酸棗仁水提液,濃縮至100 mL,冷凍干燥,得到自制酸棗仁水提物。

1.2.2定量指紋圖譜供試品溶液

取酸棗仁提取物,精密稱取約1 g置于25 mL容量瓶中,加50%(v/v)甲醇水溶液約15 mL,振蕩,超聲30 min使全部溶解或溶散,冷卻至室溫后用50%(v/v)甲醇水溶液定容,過0.22 μm濾膜,即得。

1.2.3酸棗仁皂苷含量測定供試品溶液

取酸棗仁提取物,精密稱取約0.1 g置于100 mL容量瓶中,加50%(v/v)乙腈水溶液約50 mL,振蕩,超聲20 min使全部溶解或溶散,冷卻至室溫后用50%(v/v)乙腈水溶液定容,過0.22 μm濾膜,即得。

1.3 對照品儲備液的制備

取斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B對照品各10 mg,分別置于10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別作為斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B儲備液。

1.4 分析條件

1.4.1HPLC----用于建立對照指紋圖譜和特征峰半定量及斯皮諾素含量測定

Waters Alliance HPLC系統,Waters XSelect HSS C18(250 mm×4.6mm, 5 μm)色譜柱,流動相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)洗脫,0～5 min, 10%A～15%A; 5～25 min, 15%A～20%A; 25～35 min, 20%A～30%A; 35～40 min, 30%A～95%A; 40～46 min, 95%A;流速為1.0 mL/min;進樣量為10 μL;柱溫為40 ℃;檢測波長為337 nm。

1.4.2HPLC-QTOF-MS----用于對照指紋圖譜中特征峰的鑒定

島津UHPLC系統,與AB SCIEX X500系列QTOF質譜儀聯用,LC條件中流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),其余條件同1.4.1節。離子源:ESI;負離子模式;氣簾氣:241 kPa; Gas 1: 379 kPa; Gas 2: 379 kPa;溫度:550 ℃;離子化壓力:-4 500 V,去簇電壓:-80 V;全掃描范圍:m/z50～1 500;裂解電壓:-40 V。CE Spread: 20 V。

1.4.3UPLC-QqQ-MS----用于皂苷A、B的定量測定

Waters I-Class Xevo TQ-XS UPLC-QqQ-MS儀,Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)色譜柱。流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B);梯度洗脫:0～2 min, 19%A～23%A; 2～4 min, 23%A～95%A; 4～7 min, 95%A; 7～7.1 min, 95%A～19%A; 7.1～10 min, 95%A～19%A,流速為0.3 mL/min,柱溫為30 ℃;進樣量為2 μL。離子源:ESI;正離子模式;碰撞氣,氬氣;霧化氣,氮氣;加熱氣,氮氣;毛細管電壓3.00 kV;源溫度150 ℃, MRM模式監測,皂苷質譜參數見表2。

表2 酸棗仁皂苷A和B的質譜參數

2 結果與討論

2.1 指紋圖譜的建立

取3批自制酸棗仁水提物,按1.2.2節的方法制備HPLC指紋圖譜供試品溶液,按1.4.1節的方法依次進樣檢測,將3批自制酸棗仁水提物樣品的色譜圖全部導入《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統軟件》(2012版),以第一批自制酸棗仁水提物(STW2006093)的圖譜為校正參照,使用中位數進行自動匹配,加以多點校正,可識別8個主要共有色譜峰,得到酸棗仁水提物的對照譜圖(見圖1)。選擇出峰時間穩定且相對居中的斯皮諾素峰(3號峰)作為參比峰。

圖1 酸棗仁水提物HPLC指紋圖譜及其共有模式Fig. 1 HPLC fingerprints and their common pattern of Ziziphi Spinosae Semen water extracts Mobile phase A: acetonitrile; mobile phase B: water containing 0.1% (v/v) phosphoric acid. Column: Waters XSelect HSS C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm). Gradient program: 0-5 min, 10%A-15%A; 5-25 min, 15%A-20%A; 25-35 min, 20%A-30%A; 35-40 min, 30%A-95%A; 40-46min, 95%A. Detection wavelength: 337 nm. Injection volume: 10 μL. Column temperature: 40 ℃. Flow rate: 1.0 mL/min. For peaks, see Table 3.

取批號為STW2006093的自制酸棗仁水提物,制備供試品溶液,以HPLC-QTOF-MS分析,采集質譜數據,通過比對精確相對分子質量和特征碎片離子,結合軟件推斷的分子式及文獻報道[12,13],鑒定出酸棗仁水提物8個共有峰的結構,結果見表3。

表3 酸棗仁水提物特征峰的鑒定

取15批不同廠家酸棗仁提取物,采集得到HPLC指紋圖譜(見圖2)并進行相似度分析。15批不同廠家的酸棗仁提取物指紋圖譜與共有模式對照指紋圖譜相似度分別為0.992(A), 0.947(B), 0.960(C), 0.991(D), 0.976(E), 0.966(F), 0.957(G), 0.978(H), 0.935(I), 0.961(J), 0.989(K), 0.104(L), 0.989(M), 0.950(N), 0.980(O)。相似度結果顯示,除廠家L外,14批不同廠家酸棗仁提取物的相似度均在0.9以上,但從色譜圖上看,這些提取物樣品在成分組成和含量上有著顯著差異。

圖2 15批酸棗仁提取物的HPLC指紋圖譜Fig. 2 HPLC fingerprints of 15 batches of Ziziphi Spinosae Semen extracts Peak identifications: 1. vicenin-2; 2. glucosylvitexin; 3. spinosin; 4. 6″′-feruloylspinosin; 5. 6″-O-(3-Glc-indole-acetyl) spinosin or its isomer; 6. 6″-O-(3-Glc-indole-acetyl) spinosin or its isomer; 7. 6″-O-(3-Glc-indole-acetyl)-6″′-feruloyl spinosin or its isomer; 8. 6″-O-(3-Glc-indole-acetyl)-6″′-feruloyl spinosin or its isomer.

2.2 指紋圖譜方法學考察[14]

精密度 取批號為STW2006093的自制酸棗仁水提物,制備供試品溶液,連續進樣6次,8個特征峰的相對保留時間RSD均小于1%,相對峰面積RSD小于5%,表明儀器精密度良好。

穩定性 取批號為STW2006093的自制酸棗仁水提物,制備供試品溶液,分別于0、6、12、18、24 h注入液相色譜儀,8個特征峰的相對保留時間RSD均小于1%,相對峰面積RSD小于5%,表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

重復性 取批號為STW2006093的自制酸棗仁水提物,制備6份供試品溶液,進樣測定,8個特征峰的相對保留時間RSD均小于1%,相對峰面積RSD小于5%,表明該方法重復性良好。

2.3 斯皮諾素方法學考察與含量測定

檢出限與定量限 精密吸取斯皮諾素儲備液適量,逐級稀釋后進行測定,以信噪比(S/N)為3～10作為方法的檢出限(LOD),以S/N為10～20作為方法的定量限(LOQ),得出斯皮諾素的檢出限為0.6 mg/L,定量限為1.9 mg/L。

線性關系 精密吸取斯皮諾素儲備液適量,配制成5個質量濃度系列的對照品溶液,進行測定,以斯皮諾素質量濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,繪制標準曲線,得線性回歸方程、相關系數(r2)和線性范圍,結果見表4。

表4 斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和B的線性關系和線性范圍

精密度 取斯皮諾素對照品溶液,連續進樣6次,測得斯皮諾素峰面積的RSD值為0.38%,表明儀器精密度良好。

穩定性 取批號為STW2006093的自制酸棗仁水提物,按照1.2.2節下樣品處理方法制備供試液,在制備后的0、6、12、18、24 h分別進行HPLC測定,得到斯皮諾素峰面積的RSD為0.64%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性 取同一自制酸棗仁水提物6份(批號STW2006093),分別制備供試液,測定HPLC譜圖,記錄斯皮諾素的峰面積,計算6份平行樣中斯皮諾素含量RSD為0.45%,表明本方法重復性較好。

加樣回收率 取自制酸棗仁水提物6份(批號STW2006093),每份0.5 g,精密稱定,置于25 mL容量瓶中,加入斯皮諾素1 mg,加50%(v/v)甲醇水溶液約15 mL,振蕩,超聲30 min使全部溶解或溶散,冷卻至室溫后用50%(v/v)甲醇水溶液定容,過0.22 μm濾膜后進行HPLC測定,結果顯示,斯皮諾素的回收率為90.70%, RSD為1.16%。

樣品含量測定 對3批自制酸棗仁水提物和來自15個不同廠家的酸棗仁提取物進行分析,測定斯皮諾素的含量,結果見表5。結果顯示,18批樣品中斯皮諾素含量在0～0.62%之間,含量測定的RSD均小于2%。

表5 酸棗仁提取物中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和B的含量及RSD (n=3)

2.4 酸棗仁皂苷A和B方法學考察與含量測定

檢出限和定量限 分別精密吸取酸棗仁皂苷A和B儲備液適量,逐級稀釋進樣測定,以S/N為3～10作為方法的LOD,以S/N為10～20作為方法的LOQ,得出酸棗仁皂苷A的LOD為0.007 μg/L,LOQ為0.02 μg/L,酸棗仁皂苷B的LOD為0.007 μg/L,LOQ為0.02 μg/L。

線性關系 精密吸取酸棗仁皂苷A和B儲備液適量,配制成7個質量濃度的系列混合對照品溶液,進樣測定,以質量濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,得線性回歸方程、r2和線性范圍,結果見表4。

精密度 取酸棗仁皂苷A和B對照品混合溶液,連續進樣6次測定,得到酸棗仁皂苷A和B峰面積的RSD分別為0.70%和3.29%,表明儀器精密度良好。

穩定性 取自制酸棗仁水提物(批號STW2006093),制備供試液,在制備后的0、6、12、18、24 h分別進行測定,得到酸棗仁皂苷A和B峰面積的RSD分別為1.23%和1.89%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性 取同一自制酸棗仁水提物6份(批號STW2006093),制備供試液,進樣測定,記錄酸棗仁皂苷A和B的峰面積,計算6份平行樣中酸棗仁皂苷A和B含量的RSD分別為2.35%和1.88%,表明本方法重復性較好。

加樣回收率 取自制酸棗仁水提物6份(批號STW2006093),每份0.05 g,精密稱定,置于100 mL容量瓶中,加入酸棗仁皂苷A 0.04 mg,酸棗仁皂苷B 0.02 mg,加50%(v/v)乙腈水溶液約50 mL,振蕩,超聲20 min,冷卻至室溫后用50%(v/v)乙腈水溶液定容,過0.22 μm濾膜后進行測定,結果顯示,酸棗仁皂苷A和B的回收率分別為94.14%和91.41%, RSD分別為1.27%和2.38%。

樣品含量測定 通過對3批自制酸棗仁水提物和15批不同廠家酸棗仁提取物進行分析,測定酸棗仁皂苷A和B的含量,含量測定結果見表5。結果顯示,18批樣品中酸棗仁皂苷A含量在0～0.42%之間,酸棗仁皂苷B含量在0～0.22%之間。

2.5 雷達圖分析

雷達圖分析方法是基于一種形似導航雷達顯示屏上的圖形而構建的一種多變量對比分析技術。在雷達圖中,每組評價指標都有一個獨立的單一數值軸,坐標軸呈輻射狀分布在中心點周圍,把同一評價對象的不同指標數據值在坐標軸上的點用折線連接起來所形成的多邊形就是雷達圖[15-17]。為了更加直觀地反映不同廠家酸棗仁提取物的質量差異,本研究采用雷達圖對酸棗仁提取物質量進行對比評價。使用開源軟件plotlyjs網頁繪圖庫(Plotly公司)制作雷達圖。采用3批自制的酸棗仁水提物平均值作為基準進行參照(雷達圖中紅框),選擇10個代表性成分進行評價,其中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B采用含量測定結果進行比例折算,定量指紋圖譜中其他7個黃酮共有峰采用相對峰面積進行比例折算,10個成分的含量對比雷達圖見圖3。從雷達圖中可以清晰地看到,市場提取物不僅與實驗室采用合格飲片自制的水提物含量差距較大,不同廠家之間的成分組成和含量差異也非常大,其中廠家B、C、E、F、G、H、I、O的酸棗仁提取物中代表性成分含量較低,約為實驗室正常水提含量的1/10,推測廠家為降低產品單價,酸棗仁投料較少或使用了大量輔料進行稀釋,而廠家L幾乎未檢出任何酸棗仁代表性成分,產品真實性存在較大問題。廠家D的10個成分含量都超過自制酸棗仁水提物,結合總皂苷含量>20%的質量標識和較差的水溶性,推測可能是采用醇提法制備并經樹脂純化富集的產品;廠家N的提取物中部分黃酮類成分含量略高于自制酸棗仁水提物,但不含酸棗仁皂苷A,推測可能提取用原料為酸棗仁的偽品理棗仁[18]。只有廠家A的各成分含量與自制水提物均較為接近,且酸棗仁皂苷A和B都有足夠的含量,提示其使用的原料和工藝都較為合規。上述結果表明,由于缺乏統一的質量標準要求,各廠家的酸棗仁提取物所用原料和生產工藝可能存在巨大的差異,導致其產品差異性十分巨大,酸棗仁提取物應用企業需要建立嚴格的內控質量評價體系,對這些原料進行篩選,合理應用。

圖3 15批酸棗仁提取物雷達圖Fig. 3 Radar-gram of 15 batches of Ziziphi Spinosae Semen extracts For peaks, see Table 3.

3 結論

本文建立了8個共有黃酮峰為代表的酸棗仁水提物HPLC定量指紋圖譜,并通過液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用鑒定了共有峰的可能成分。結合斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和B定量結果,以及定量指紋圖譜中其他7個共有峰的相對定量結果進行雷達圖評價。結果顯示,不同廠家提供的酸棗仁提取物存在非常大的差異,對比實驗室按照正常水提工藝的樣品,可能存在大量輔料稀釋甚至不含有效成分,以及理棗仁摻假、醇提富集等情況。本文所建立的HPLC定量指紋圖譜結合液相色譜-質譜聯用定量分析方法,可全面、系統地應用雷達圖呈現酸棗仁提取物的質量差異,為酸棗仁提取物應用企業根據自身產品分類和市場定位建立合理內控質量標準并篩選合格供應商提供重要參考。